飼料中乙烯雌酚含量的檢測方法研究

李東　單曉麗　周峰

摘 要：本研究旨在開發(fā)一種高效、經(jīng)濟的方法，利用高效能液相層析儀（HPLC）配合光二極管偵測器（PDA），對飼料中乙烯雌酚含量進行分析。為了避免在低濃度情況下的誤判，同時采用高效液相層析質(zhì)譜儀（HPLC/MS）進行了再確認。在實驗中，飼料樣品以甲醇為萃取液，經(jīng)過振蕩、離心、濃縮上清液，殘渣用70%甲醇溶解，通過Oasis?HLB卡匣去除干擾物質(zhì)，最后用甲醇進行沖提，沖提液經(jīng)高效液相層析儀檢測。實驗結(jié)果表明，對于飼料添加0.5、1、3、5 ppm的情況，回收率在80.8%到107.5%。僅采用光二極管偵測器檢測時，最低檢測限為0.03 ppm；而采用質(zhì)譜偵測器檢測時，最低檢測限可達0.005 ppm。研究結(jié)果表明，所開發(fā)的高效液相層析儀飼料中乙烯雌酚檢測方法具有便捷、經(jīng)濟、可行的特點，可作為飼料中乙烯雌酚檢驗的一種有效方法。

關(guān)鍵詞：乙烯雌酚，高效能液相層析儀（HPLC），光二極管偵測器（PDA），飼料分析，液相層析質(zhì)譜儀（LC/MS）

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.10.034

0 引 言

乙烯雌酚是由英國內(nèi)科醫(yī)師查爾斯 多茲（CharlesDodds等）于1938年開發(fā)的一種合成雌激素。由于其比天然雌激素具有更強的效果、生產(chǎn)成本低、口服方便等優(yōu)點，因此被廣泛用于預(yù)防流產(chǎn)、早產(chǎn)以及減輕更年期障礙癥狀[1]。在農(nóng)業(yè)方面，由于乙烯雌酚對牛、雞和綿羊具有顯著的促進生長和提高飼料利用率的作用，自1941年起曾廣泛應(yīng)用。

近年來，氣相層析質(zhì)譜儀（GC/MS）檢測乙烯雌酚的方法得到了廣泛應(yīng)用。然而，由于GC/MS的前處理過程繁瑣，需要經(jīng)過衍生化后才能進行檢測，因此液相層析質(zhì)譜儀（LC/MS）檢測方法成為新的發(fā)展趨勢[2]。盡管質(zhì)譜儀具有高靈敏度、高分辨率和專一性等優(yōu)點，但由于其昂貴的價格和高昂的維護費用，如果應(yīng)用于例行檢測業(yè)務(wù)，相對成本也較高。因此，本研究嘗試開發(fā)一種以廣泛應(yīng)用的高效能液相層析儀結(jié)合光二極管偵測器的方法，用于分析飼料中的乙烯雌酚含量，并通過質(zhì)譜儀進行再確認[3]。本實驗的目的在于開發(fā)一種更為便捷和經(jīng)濟的方法，以檢測飼料中乙烯雌酚的含量，以便應(yīng)用于飼料查驗管理，預(yù)防乙烯雌酚的違法使用，確保畜產(chǎn)品的安全和消費者的健康。

1 材料及方法

1.1 儀器設(shè)備及器材

溶液輸送系統(tǒng)及自動采樣注射器：Alliance2695；

光二極管偵測器：Water s 29 9 6 Photodiode Array Detector；

質(zhì)譜偵測器：ZQ4000；

層析資料處理系統(tǒng)：Waters Empower Software分析管柱：Atlantis?C185μm，4.6x150mm超音波振蕩器：BRANSON8510；

離心機：KUBOTA5010；

減壓濃縮機：HEIDOLPH WB2001/VV2011；

固相萃取匣：Oasis?HLB 3cc/60mg Extractioncartridge。

1.2 標準品及試藥

標準品：diethylstilbestrol；

溶劑：甲醇、蒸餾水。

1.3 檢量線制作

（1）將乙烯雌酚標準品以甲醇稀釋成濃度為10 0 μg /mL的標準原液。取適量的標準原液，以甲醇分別稀釋成0.25、0.5、1、3、5 μg /mL等5種濃度的工作液，H PLC / PDA分析條件的移動相為methanol∶H2O＝65∶35，流速設(shè)定為1 mL/min，偵測波長為240 nm，每種濃度注入20 μL，重復(fù)分析三次，測定波峰面積以制作檢量線。

（2）取適量的標準原液，以甲醇分別稀釋成0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 μg/mL共5種濃度，HPLC/MS分析條件設(shè)定為ESI Negative Mode的離子模式，準分子離子峰（SIR）為「M-H」-267，Capillary Voltage為3.3 kV，Cone Voltage為35 V，每種濃度重復(fù)分析3次，制作一檢量線。

1.4 飼料中乙烯雌酚分析

取空白飼料，添加乙烯雌酚，使飼料中乙烯雌酚的含量分別為0.01、0.05、0.1、0.5、1、3、5 ppm。各組飼料分別取5 g（3份）加入40 mL甲醇，置于超音波震蕩器震蕩30分鐘后，離心10分鐘（3000 rpm），取上清液減壓濃縮至干，以70%甲醇5 mL溶出。取2 mL的溶出液注入Oasis?HLB3 cc/60 mg卡匣內(nèi)（預(yù)先以3 mL甲醇活化及3 mL水平衡），以3 mL70％甲醇洗凈后，再以甲醇2 mL沖提，沖提液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，注入液相層析儀測定。

2 結(jié) 果

根據(jù)上述分析條件以HPLC/PDA分析乙烯雌酚標準品5種濃度（0.25、0.5、1、3、5 μg/mL），所得結(jié)果由層析結(jié)果中可見于波長240 nm下，滯留時間9.49分鐘有一明顯吸收峰。波峰面積的相對標準偏差介于0.4％～3.4％之間，檢量線Y=552.5+66247.2X，線性系數(shù)為r 2=0.99998（見表1）。

檢量線 Y=552.5+66247.2X；

相關(guān)系數(shù) r 2=0.99998。

以H P L C / M S 分析乙烯雌酚標準品5種濃度（0.0 05、0.01、0.05、0.1、0. 5 μg /mL），所得結(jié)果由質(zhì)譜結(jié)果顯見其吸收峰，檢量線的相關(guān)系數(shù)r 2 = 0 . 9 9 8 5，波峰面積的相對標準偏差為1.62%～10.60%（見表2）。

檢量線Y=191502.1+37690.2X

相關(guān)系數(shù)r 2=0.9985

最低檢測界限及最低定量界限依公式LOD=3.3σ/S及LOQ＝10σ/S（式中σ為回歸線在y軸的截距的標準差，S為分析物檢量線的斜率），可得最低檢測極限為0.028 ppm，最低定量極限為0.084 ppm。

飼料中添加乙烯雌酚0.5、1.0、3.0、5.0 ppm4種濃度，依上述分析條件與飼料前處理方法處理分析后，結(jié)果顯示其平均回收率為80.8％～107.5%，相對標準偏差為0.8%～6.0%（見表3）。

于空白飼料添加乙烯雌酚0.05 ppm，經(jīng)飼料前處理以LC/PDA/MS偵測結(jié)果，由以SIR（Select IonRecording）267偵測特定分子量的質(zhì)譜，相較于所得的層析，發(fā)現(xiàn)運用質(zhì)譜儀檢測時，可減少噪聲干擾，降低偵測極限。

飼料中乙烯雌酚的濃度雖有添加至0.1、0.05、0.01 ppm，但由分析所得結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以HPLC/PDA偵測時僅能準確定量至0.5 ppm，為避免低濃度所造成誤判的困擾，遂以HPLC/MS進行檢測。在質(zhì)譜儀檢測下，可準確定性至0.01 ppm。

3 討論

本實驗主要應(yīng)用固相萃取技術(shù)進行飼料的前處理，然后以高效能液相層析儀配合光二極管偵測器進行檢測飼料中乙烯雌酚的含量。本實驗參考Alda D L J M ，Barceló D，2001與Y M ，2000所使用的C18 Vac及Oasis? HLB[4]二種固相萃取卡匣進行試驗后，發(fā)現(xiàn)SPE C18 Vac回收率為84.2%，Oasis?HLB回收率為99.7%，這表明在此條件下Oasis? HLB滯留效果較C18Vac為佳。另外也曾嘗試運用不同極性溶劑（如乙氰、乙醚、丙酮、氯仿等）萃取飼料中乙烯雌酚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用的溶劑極性愈低時，會同時將飼料中油脂萃取出，導(dǎo)致凈化困難，因此在考慮去油脂與相關(guān)有機溶劑的環(huán)保問題下，遂選用甲醇作為萃取液。在飼料前處理過程中減壓濃縮步驟應(yīng)是影響本次實驗回收率的主因，未來可嘗試使用大容量的固相萃取匣直接進行凈化，減少濃縮回溶所造成的損失，應(yīng)可再提高回收率。

本實驗最初以HPLC/ PDA檢測飼料中乙烯雌酚含量，于結(jié)果顯示飼料中添加乙烯雌酚濃度愈低時，其回收率反而愈高，推測可能因藥品濃度愈低，相對基質(zhì)的干擾也愈低所致，如加強樣品前處理，去除干擾物質(zhì)，回收率應(yīng)可獲得改善。

飼料中添加乙烯雌酚經(jīng)前處理后，以LC/PDA/MS偵測結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)于低濃度時運用質(zhì)譜儀檢測，不僅可減少噪聲干擾，降低偵測極限，亦可避免造成誤判。雖然應(yīng)用質(zhì)譜儀檢測時可明顯見其吸收峰，但由于經(jīng)離子化過程的變異因子如溫度、氣體流速等影響，導(dǎo)致偵測結(jié)果的重復(fù)性不佳，波峰面積相對標準偏差大于10%，如要準確定量仍須添加內(nèi)標準品加以校正，以達準確的定量結(jié)果。

4 總 結(jié)

本研究致力于發(fā)展一種經(jīng)濟高效的方法，利用高效能液相層析儀（HPLC）結(jié)合光二極管偵測器（PDA），對飼料中的乙烯雌酚含量進行準確測定。乙烯雌酚因其在農(nóng)業(yè)中促進生長的作用而曾被廣泛使用。本研究采用固相萃取技術(shù)進行飼料前處理，以甲醇為溶劑，通過HPLC/PDA進行初步分析，并結(jié)合質(zhì)譜儀進行再確認，旨在確保畜產(chǎn)品的安全性和消費者的健康。

在實驗中，通過選擇適宜的固相萃取卡匣（Oasis? HLB），優(yōu)化溶劑和萃取步驟，提高了乙烯雌酚的回收率。HPLC/PDA分析結(jié)果表明，所建立的檢量線具有良好的線性關(guān)系和重現(xiàn)性。同時，通過引入HPLC/MS技術(shù)，成功降低了噪聲干擾，提高了檢測的敏感性，尤其在低濃度范圍內(nèi)的準確性得到了顯著提升。

通過在飼料中添加不同濃度的乙烯雌酚進行分析，驗證了該方法在實際應(yīng)用中的可行性。實驗結(jié)果顯示，該方法的最低檢測限為0.028 ppm，最低定量限為0.084 ppm。對于添加乙烯雌酚的飼料樣品，所獲得的平均回收率為80.8％～107.5%，相對標準偏差為0.8%～6.0%，證明了該方法的可靠性和穩(wěn)定性。

總體而言，本研究成功地利用HPLC/ PDA和HPLC/MS相結(jié)合的方法，對飼料中乙烯雌酚進行高效、經(jīng)濟、準確的檢測。該方法為飼料查驗管理提供了一種可行的手段，確保了畜產(chǎn)品的安全性，維護了消費者的健康。

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作者簡介

李東，本科，工程師，研究方向為玻璃纖維增強塑膠、肥料、飼料、化工產(chǎn)品、食品、食用農(nóng)產(chǎn)品檢驗檢測。

（責(zé)任編輯：張瑞洋）