基于RNA-Seq 探究蔗糖影響黑果枸杞枝刺發生的機理

摘 要：【目的】黑果枸杞Lycium ruthenicum 是集生態、經濟和藥用價值等為一體的灌木。然而，其密集的枝刺嚴重阻礙其作為經濟林推廣，本研究旨在探究蔗糖（Suc）促進黑果枸杞（黑杞）枝刺的發生機理，為培育其無刺優良品種提供依據。【方法】在證明Suc 通過能量和信號路徑促進黑杞枝刺發生的基礎上，利用RNA-Seq對無刺莖頂芽（TleCK）、有刺莖頂芽（ThoCK）、黑暗處理的有刺莖頂芽（ThoDCK）、減少內源Suc 處理后有刺變無刺莖頂芽（TleDPL）和噴施外源Suc 后無刺變有刺莖頂芽（ThoSuc）5 種樣品的差異表達基因（DEG）和葉綠體差異基因（cpDEG）進行篩選和分析，并采用RT-qPCR 驗證了9 個DEG 的表達情況。【結果】5 組有刺和無刺材料頂芽之間（ThoCK vs. TleCK、ThoCK vs. TleDPL、ThoDCK vs. TleDPL、TleCK vs. ThoSuc 和TleDPL vs. ThoSuc）的DEG 分別為5 281、4 363、3 125、5 226 和3 278 個，這5 組DEG 共同顯著富集在9 個GO 條目和4 個KEGG 通路（“類黃酮生物合成”“二萜生物合成”“苯丙烷生物合成”、“芪類、二芳基庚烷和姜辣素生物合成”）。韋恩圖顯示5 組比較組共有的DEG 是196 個，其中33 個被預測為轉錄因子基因，較多轉錄因子基因被預測為NAC 和WRKY 家族。5 組比較組有3 個共有DEG 注釋在植物激素信號轉導KEGG通路，分別參與生長素、茉莉酸和水楊酸信號傳導。3 個關鍵有刺和無刺比較組（ThoCK vs. TleCK、ThoCK vs.TleDPL 和TleCK vs. ThoSuc）中共有2 個DEG 被預測為TCP 轉錄因子基因，這3 個比較組均有cpDEG 被注釋到光合作用KEGG 通路。9 個DEG 的RT-qPCR 驗證了RNA-Seq 結果的可靠性。【結論】Suc 可能通過影響生長素、茉莉酸和水楊酸信號傳導以及赤霉素合成基因表達來促進黑杞枝刺發生，枝刺發生也可能與類黃酮積累和木質素減少有關，而且增施外源和減少內源Suc 并非通過簡單地逆轉cpDEG 的表達來影響枝刺發生。注釋到WRKY、TCP 和NAC 轉錄因子家族的共有DEG 可能是調控枝刺發生的關鍵基因。本研究建立了Suc 影響黑杞枝刺發生的機理模型圖。

關鍵詞：黑果枸杞；頂芽；枝刺；RNA-Seq；蔗糖

中圖分類號：S665.9 文獻標志碼：A 文章編號：1003—8981（2024）01—0126—14

黑果枸杞Lycium ruthenicum 屬茄科多年生灌木，兼具生態、經濟和藥用價值[1]，具有抗旱、抗寒、抗風沙、耐鹽堿和耐貧瘠的特性[2]，已被用來修復我國西北地區鹽漬化土壤[3]，是西北地區的特色植物資源[4]，在沙漠生態系統的恢復中發揮著重要作用[5]。最新研究表明，黑果枸杞（黑杞）含有豐富的多糖、花青素、黃酮類化合物、甜菜堿和多酚類化合物等活性成分[6]，尤其是花青素含量特別高，具有抗氧化[7]、抗炎[8]、緩解記憶障礙[9]、調節腸道菌群[8]、護肝[10] 等功能，且被用來穩定食品并延長食品保質期[11]。此外，黑杞含17 種氨基酸[12]，還富含酚酸、類胡蘿卜素、生物堿、維生素、精油等多種成分[13]，果實可以直接食用或用于制作營養食品和飲料的原料[14]。

植物刺類型多樣，在被子植物中常見，在相對低等的裸子植物中較少見，主要有保護、警戒、攀援和抗逆作用[15]。相比于側枝，植物枝刺的研究相對滯后。黑杞的刺為枝刺，本課題組前期顯微觀察發現黑杞枝刺起源于葉腋處的刺原基；在充分的土壤水分條件下，組培無性黑杞盆栽的刺原基可以不發育為可見枝刺，干旱促進無性系盆栽產生可見枝刺[16]；黑杞的刺原基發育為可見枝刺后覆蓋腋芽，可能在保護腋芽中起重要作用，黑杞枝刺的有無與該莖節處葉片基因組DNA 的甲基化修飾有關[16]。本課題組通過穩定遺傳轉化發現黑杞蔗糖合酶基因（LrSUS）促進其枝刺的發生[17]，發現0.1 mg/L 外源IAA 處理抑制黑杞有刺莖新生莖節枝刺發生[18]。對柑橘Citrus 的研究發現采用CRISPR/Cas9 方法構建的ti1 ti2 雙突變體植株表現出幾乎每根枝刺都轉化分枝[19]。Zhang等[20] 發現轉基因柑橘CsCEN-OX 的前16 個節中有超45% 的枝刺轉化為休眠芽，約15% 的枝刺轉化為休眠分枝，同時構建的cscen ti1 ti2 三突變體表現出與ti1 ti2 雙突變體相似的表型，cscen ti1ti2 三突變體幾乎每根枝刺也向分枝轉化。盡管植物枝刺有重要的作用，但是參照沙棘Hippophaerhamnoides‘無刺豐’和刺鈍化的寧夏枸杞Lyciumbarbarum 的優良生產表現，推測同等條件的無刺、少刺或刺鈍化黑杞更適宜作為經濟林栽培。

至今尚未發現完全無刺黑杞，前期研究曾發現黑杞一個組培無性系枝刺的表型具備可塑性。該無性系于組培瓶中時均無肉眼可見枝刺，移栽后置于玻璃溫室的相同條件下，會出現完全無刺（肉眼觀測）和有刺兩種類型，且其無刺類型單簇葉片數量也顯著少于有刺類型[21]；移栽大田之后，該無性系有刺和無刺植株的新發莖又均能產生肉眼可見的枝刺。本研究以上述溫室無性系盆栽的有刺和無刺植株為原始材料，在發現增施外源蔗糖（Suc）促進枝刺發生、減少內源Suc 抑制枝刺發生的基礎之上[21]，以對照有刺和無刺植株頂芽、黑暗處理的有刺莖頂芽、增施外源Suc 后無刺變有刺莖頂芽、減少內源Suc 后有刺變無刺莖頂芽共5 類為實驗材料，采用高通量轉錄組測序（RNA-Seq）和實時熒光定量PCR（RT-qPCR）的方法探索Suc 影響枝刺發生相關的關鍵基因和代謝路徑。本研究挖掘了Suc 影響黑杞枝刺發生的相關基因和代謝路徑，為培育黑杞無刺、少刺優良品種和其他枝刺植物的分子育種奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用玻璃溫室1 年生有刺和無刺黑杞長度為15 ～ 25cm 的新發枝條為原始試驗材料，進行增施外源和減少內源Suc 的處理。所有植株均來自一個黑果枸杞組織培養無性系[16]。此外，無刺植株整枝無肉眼可見枝刺，有刺植株枝條通常從上往下數的前4 ～ 5 個莖節無肉眼可見枝刺，其余莖節有肉眼可見枝刺，但隨著發育的進行，所有莖節將逐漸依次出現肉眼可見枝刺。采用原始有刺、無刺莖頂芽、黑暗處理后有刺莖頂芽、增施外源和減少內源Suc 處理后刺表型顯著變化的枝條頂芽為試驗材料，進行RNA-Seq 以及RT-qPCR分析。

1.2 噴施外源Suc 和減少內源Suc 處理

前期研究顯示，黑杞有刺莖頂芽的Suc 含量顯著高于無刺莖頂芽[21]，推測外源施加Suc 能促進黑杞枝刺發生，減少內源Suc 合成能抑制其枝刺發生。因此，對無刺和有刺黑杞分別進行增施外源和減少內源Suc 的處理。參照前期報道[22]，本研究采取噴施外源Suc 方法來提高內源Suc 的含量。具體方法如下：采用46.74 mmol/L 的Suc 溶液噴灑健康、生長狀態一致的無刺黑杞枝條，對照噴施等量清水，每日每盆噴灑3 mL 溶液或清水。參照前人的報道，本研究采用黑暗[23] 聯合去葉[24-25] 的方法來降低內源Suc 含量。具體方法為先黑暗處理盆栽48 h 消耗其內源糖，然后將黑暗處理后的一半材料作為對照組，不做任何其他處理；另外一半為去葉組（保留頂芽處4 ～ 6 片葉，其余葉片摘除）。整個處理周期內，去葉組頂芽處始終保留4 ～ 6 片葉。以上試驗均設置3 次生物學重復，每個重復處理10 盆（灌木多枝）。處理14 d 后，統計分析各類對照和處理材料新發莖的有刺莖節率。因為無刺和有刺枝條的頂端4 莖節均無肉眼可見枝刺，因此新發莖有刺莖節率= 有刺的新發節數/（新發總節數- 頂端4 節數）×100%。

1.3 RNA-Seq 分析

前期對未經處理的黑杞無刺（TleCK）和有刺（ThoCK）莖頂芽2 種材料進行過RNA-Seq 分析，探索影響枝刺發生的基因[21]。為了進一步探索哪些基因通過響應增施外源、減少內源Suc 處理來影響黑杞枝刺發生，采用RNA-Seq 分析比較未經處理的無刺和有刺黑杞莖頂芽、黑暗處理的有刺黑杞莖頂芽（ThoDCK）、有刺黑杞減少內源Suc 處理后新生完全無刺莖的頂芽（TleDPL）、無刺植株增施外源Suc 處理后新發的變有刺莖頂芽（ThoSuc）5 種材料。每種材料設置3 次生物學重復，每個重復含50 個左右的頂芽，樣品送至中國南京派森諾公司進行RNA-Seq 分析。

1.3.1 RNA 制備、文庫構建、測序與組裝

采用Invitrogen 的TRlzol 試劑，按照制造商說明提取上述5 種材料的總RNA，采用RNA 專用瓊脂糖電泳檢測。通過Oligo（dT）磁珠富集總RNA 中帶有polyA 結構的mRNA，采用離子打斷的方式，將mRNA 片段化后合成cDNA。通過Agilent 2100 Bioanalyzer 對構建完成的文庫進行質檢。基于Illumina HiSeq 測序平臺，對這些文庫進行雙末端測序。使用Trinity 軟件對Clean Reads 進行拼接得到Transcript 后再進行后續分析。

1.3.2 表達量、樣品相關性分析

本研究進行無參RNA-Seq 分析。使用轉錄組表達定量軟件RSEM，以Transcript 序列為參考，分別將每個樣品的Clean Read 比對到參考序列上。利用RSEM 計算各個樣品的基因表達水平[26]。采用皮爾遜相關系數r 作為樣品間基因表達水平相關性的評估指標。

1.3.3 功能注釋、差異表達及轉錄因子分析

利用NR、GO、KEGG、eggNOG、Swiss-Prot和Pfam 數據庫對基因進行功能注釋。首先，與常規無參RNA-Seq 一樣，采用DESeq 對基因表達進行差異分析[27]，將差異倍數|log2Fold Change| ＞1 且顯著性P ＜ 0.05 的認定為差異表達基因（DEG）。其次， 將測序Clean Read 比對到黑杞葉綠體參考基因組（SRX19877303），將符合|log2Fold Change| ＞ 1 且P ＜ 0.05 的葉綠體基因篩選為葉綠體差異基因（cpDEG）。本研究之所以篩選cpDEG，是因為有刺和無刺材料Suc 含量及葉片數量的差異提示刺的發生可能與光合作用相關，而光合作用的場所為葉綠體且受葉綠體基因影響[28]。采用超幾何檢驗確定DEG 顯著富集的GO 條目和KEGG 通路。使用topGO 進行GO 富集分析，將FDR ＜ 0.05 定義為顯著富集的GO 條目。選取P ＜ 0.05 的KEGG 通路為DEG 顯著富集的KEGG 通路。被上調DEG顯著富集（P ＜ 0.05）的DEG 通路被認定為顯著上調的KEGG 通路；被下調DEG 顯著富集的被認定為顯著下調的KEGG通路。根據5 組有刺和無刺比較組（ThoCK vs.TleCK、TleDPL vs. ThoSuc、ThoCK vs. TleDPL、ThoDCK vs. TleDPL 和TleCK vs. ThoSuc）之間的DEG 繪制Venn 圖，用來展示各比較組間DEG 的個數以及重疊關系。將DEG 與PlantTFDB（PlantTranscription Factor Database）數據庫比較，從而進行轉錄因子預測。

1.4 RT-qPCR

RT-qPCR 的材料、生物學重復與RNA-Seq材料相同。對提取出達標的RNA 進行反轉錄合成第一鏈cDNA。按照制造商的說明，使用HiScript? Ⅱ Q RT SuperMix for Qpcr（+gDNAwiper）進行反轉錄。隨機選擇9 個高表達DEG進行RT-qPCR 分析， 按照論文[21] 的標準篩選SCAB3IX1 作為內參基因。定量反應體系按照ChamQ Universal SYBR Qpcr Master Mix 的說明進行，RT-qPCR 條件為：95 ℃ 10 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s（45 個循環），設置3 次重復，采用2?ΔΔCT 方法[29] 計算基因的相對表達水平。

1.5 數據統計分析

利用SPSS 20.0 軟件對RT-qPCR 結果數據進行配對樣本T 檢驗分析（P ＜ 0.05，0.01，0.001），對有刺莖節率數據進行配對樣本T 檢驗（P ＜ 0.05）和單因素方差分析（LSD，P ＜ 0.05）。

2 結果與分析

2.1 增施外源和減少內源Suc 處理后刺表型變化

外源噴施Suc 會促使原本完全無刺莖（圖1A）的新生莖節發生大量可見枝刺（圖1B），同時單簇葉片數量也有所增加（圖1B）。噴施Suc處理后新發莖有刺莖節率為90.08±0.84%，顯著高于清水對照組（11.91±0.09%）。此外，Suc 處理組的刺長和刺寬也均顯著高于對照組[21]。對有刺植株做黑暗聯合去葉處理顯著抑制新發枝條枝刺發生，處理后有刺莖節率僅為33.98±3.08 %，顯著低于未處理的有刺對照（98.11±1.89 %），處理后新生莖節甚至無任何可見枝刺發生（圖1C）。但是，單獨黑暗處理并不能抑制枝刺發生（圖1D）。

2.2 RNA-Seq 建庫、組裝及Unigene 功能注釋

5 種15 個樣品測序，總共獲得98.56 Gb 的Clean Data。每個樣品的Q30 值達93.20 % 以上。經過Trinity 組裝共得到87 336 個Unigene，其中長度大于N50 的序列總數為15 956，Unigene 的GC 含量38.25 %。有6 666 個Unigene 在6 個數據庫中均有被注釋，基因總注釋率為51.59 %。

2.3 差異表達分析

2.3.1 5 類樣品間的相關性

5類共15個樣品均來自一個黑杞組培無性系，結果顯示每類樣品的3 次生物學重復均優先歸為一類，同類樣品生物學重復之間的相關系數多數為1（圖2），這可能是因為每次生物學重復頂芽數量較多（50 左右）且均為一個無性系。說明本研究的生物學重復相關性極強，實驗可靠。

2.3.2 DEG 統計

差異表達分析顯示有刺和無刺對照（ThoCKvs. TleCK）之間的DEG 數量最多（5 281），其中無刺對照中上調的基因數（3 777）多于下調的基因數（1 504）（圖3）。除上述對照組外，ThoCK vs. TleDPL 以及TleCK vs. ThoSuc 是用于揭示響應Suc 且影響枝刺發生關鍵基因的最核心組別，其DEG 數分別是4 363 和5 226，且有刺材料中上調DEG 數均小于下調數（圖3）。

2.3.3 DEG 的Venn 圖統計

為了更加嚴格地篩選與黑杞枝刺發生相關的關鍵候選基因，對5 個有刺和無刺比較組的DEG繪制Venn 圖，發現這5 組對比組共有的DEG 為196 個（圖4），這196 個DEG 很可能就是影響黑杞枝刺發生的關鍵基因，可用于后續開展深入的研究。

2.3.4 DEG 的GO 富集

GO 數據庫注釋主要分為3 類： 生物過程（BP）、細胞成分（CC）和分子功能（MF）。這5 組比較組的DEG 共同顯著富集在MF 的1 個GO 條目和BP 的8 個GO 條目，這9 個GO 條目表明黑杞枝刺發生可能響應酸性化合物、含氧復合物、內源性刺激、激素、損傷、刺激、壓力，并可能與氧化還原酶活性及氧化還原過程相關。

2.3.5 DEG 顯著富集的KEGG 代謝通路

5 個有刺和無刺比較組DEG 共同顯著富集4 個KEGG 代謝通路（表1），表明黑杞枝刺的發生可能與類黃酮、苯丙烷、二萜、芪類、二芳基庚烷、姜辣素等次生代謝物有關，其中的2 個KEGG 代謝通路（類黃酮生物合成，芪類、二芳基庚烷和姜辣素生物合成）在3 個關鍵比較組（ThoCK vs. TleCK、ThoCK vs. TleDPL、TleCKvs. ThoSuc）的無刺材料（TleCK 和TleDPL）中均被下調DEG 顯著富集。這表明低Suc 可能通過降低類黃酮、芪類、二芳基庚烷和姜辣素生物合成來抑制黑杞枝刺發生，高Suc 則可能相反。5 組比較組共有的196 個DEG 中有4 個注釋在上述2個共同顯著富集的KEGG 通路；注釋到二萜生物合成通路2 個DEG 中的1 個（赤霉素3-β- 雙加氧酶基因GA3ox1）在5 個比較組的無刺材料中均上調，而另外1 個DEG（四甲基十六碳四烯醇合酶GES）則在所有無刺材料中均下調；注釋到苯丙烷生物合成KEGG 通路的2 個DEG 中的1 個（過氧化物酶47 Perid47）在5 個比較組的無刺材料中均上調，而另外1 個DEG（木質素形成陰離子過氧化物酶基因LFAP）的表達雖然沒有這么一致的規律，但是在4 個比較組（除去ThoDCKvs. TleDPL）無刺材料中均表現為上調。植物激素信號轉導KEGG 通路被4 個有刺和無刺比較組（ThoCK vs. TleDPL、ThoDCK vs. TleDPL、TleCK vs. ThoSuc 和TleDPL vs. ThoSuc） 的DEG顯著富集，此通路雖然沒被ThoCK vs. TleCK 比較組的DEG 顯著富集，但是這5 組有3 個共有的在無刺材料中均上調或下調的DEG 參與該通路。其中，基因JAZ（蛋白TIFY 10A- 樣異構體X2 基因）在所有5 個比較組的無刺材料中均下調，其表達產物位于茉莉酸信號通路，且參與泛素介導的蛋白水解。假定蛋白H5410 _ 039438 基因SAUR 在無刺材料表達均上調，其表達產物位于生長素信號通路，參與細胞增大植株生長；PR1 蛋白前體基因PR-1 在無刺材料中表達均上調，且其表達產物位于水楊酸信號通路，參與抗病性。以上發現說明Suc 影響黑杞枝刺發生可能與茉莉酸、生長素和水楊酸信號的傳導及相關基因有關。另外，ThoCK vs. TleCK、ThoDCK vs. TleDPL 和TleCKvs. ThoSuc 這3 組的DEG 均顯著富集在淀粉和蔗糖代謝KEGG 通路，3 組共有DEG 在TleCK vs.ThoSuc 組的有刺材料中表達上調，此DEG 參與Suc 降解過程，注釋信息為α- 葡萄糖苷酶（AG）（表2）。這表明Suc 處理后黑杞頂芽內源Suc 降解可能會顯著提高。此外，在另兩個比較組（ThoCKvs. TleCK 和ThoDCK vs. TleDPL） 的有刺樣品（ThoCK 和ThoDCK）中該DEG表達亦上調（表2）。以上結果證明AG 基因的高表達與枝刺發生相關，降低該基因的表達有可能會成功抑制枝刺發生。

2.3.6 葉綠體cpDEG

本部分重點分析3 個關鍵比較組（ThoCK vs.TleCK、TleCK vs. ThoSuc 和ThoCK vs. TleDPL）的DEG 和cpDEG 注釋到光合作用KEGG 通路的情況。黑杞ThoCK vs. TleCK 組共有4 個cpDEG（表3），在無刺樣品（TleCK）中表達均下調，且其表達產物均參與光合作用KEGG 通路（圖5）；在無參轉錄組DEG 篩選中發現該比較組有9 個DEG 注釋到光合作用KEGG 通路。因為回貼葉綠體基因組的有參分析方法可以更準確地篩選出黑杞cpDEG，因此將無參RNA-Seq 分析得到的注釋到光合作用KEGG 通路且來自葉綠體基因組的DEG 去掉，剩余的6 個細胞核DEG 表達產物是光系統Ⅱ（PS Ⅱ）、PSI 和光合電子傳遞鏈的組成部分，且其中5 個在無刺材料下調（圖5）。TleCK vs. ThoSuc 組3 個cpDEG 在Suc 處理后有刺樣品（ThoSuc）中表達下調，其中2 個cpDEG注釋到光合作用KEGG 通路，另外1 個編碼RNA聚合酶PEP 的β″ 亞基[30]（表3）；分析該組的無參RNA-Seq 發現2 個細胞核DEG 注釋到光合作用KEGG 通路，1 個PetF 基因在無刺材料上調，另外1 個PetC 基因則下調。ThoCK vs. TleDPL組cpDEG 有2 個注釋到核糖體KEGG 通路，表達核糖體蛋白，且一個上調一個下調；該組有1個cpDEG 在無刺樣品表達下調且注釋到光合作用KEGG 通路（表3）。此外，該組的無參DEG 篩選發現3 個細胞核DEG 注釋到光合作用KEGG 通路，其中2 個DEG（分別表達PetC 和PetF）在無刺材料表達上調，1 個PetF 基因表達下調。3 個關鍵比較組無共有的cpDEG（表3），也無共有的注釋到光合作用KEGG 通路的細胞核DEG。

2.3.7 差異轉錄因子

5 組比較組共有的196 個DEG 中被預測為轉錄因子的DEG 有33 個，主要分布于NAC、bHLH、WRKY 這3 個轉錄因子家族。此外，本研究中的3 組關鍵比較組（ThoCK vs. TleCK，ThoCK vs. TleDPL 和TleCK vs. ThoSuc） 的共有轉錄因子中有兩個注釋為TCP4（TRINITY_DN3219_c1_g3、TRINITY_DN17710_c0_g1），且在無刺材料（TleCK 和TleDPL）均表達下調。

2.4 RT-qPCR 驗證RNA-Seq 結果可靠

RT-qPCR 結果表明，9 個DEG 在ThoCK vs.TleCK 比較組（ 圖6A—B）、ThoCK vs. TleDPL比較組（圖6C—D）、ThoDCK vs. TleDPL 比較組（圖6E—F）、TleCK vs. ThoSuc 比較組（圖6G—H）和TleDPL vs. ThoSuc 比較組（圖6I—J）中的表達差異情況與RNA-Seq 中的一致，這表明本研究的RNA-Seq 實驗結果準確可靠。

3 結論與討論

3.1 討 論

黑杞枝刺表型具備典型的可塑性，同一無性系于試管內、溫室內和露天條件下枝刺表型不同[16]。在溫室內相同條件下同一移栽無性系可以出現有刺和無刺兩種類型。本研究和我們前期研究[21]均發現刺的有無與頂芽Suc 含量有關：增施外源Suc 促進其枝刺發生，反之抑制其枝刺發生。Suc通過能量和信號雙重作用促進黑杞枝刺發生[21]。本研究以溫室內原本的無刺和有刺植株為原始材料，增施外源和減少內源Suc 后枝刺發生率有明顯變化，甚至從有刺變為完全無刺或者從無刺變為完全有刺的狀態。選取5 種材料頂芽為試驗材料，進行RNA-Seq 分析，以揭示Suc 通過哪些基因和路徑來影響溫室內黑杞無性系的枝刺表型可塑性。

GO 富集分析顯示5 組有刺和無刺比較組的DEG 共同顯著富集在BP 的響應刺激、激素、傷害、脅迫等GO 條目，這些條目多數與植物防御和脅迫相關。并且研究還發現，土壤干旱脅迫促進黑杞無性系枝刺的發生[16]，前人研究發現火燒[31] 和動物取食[32] 等脅迫可以促使植物增加分配給刺的生物量，刺屬于植物的誘導防御性器官。因此推測黑杞枝刺發生也會響應各類脅迫并與上述富集GO 條目的DEG 息息相關。

植物可能會利用次生代謝產物作為防御非生物脅迫的機制[33]，皮刺是植物防御的一種方式，它的形成與一些特定的次生代謝產物積累有關[34-35]，包括黃酮類化合物、萜類化合物和生物堿[36]。關于植物枝刺發生和次生代謝產物的相關性，目前未檢索到報道。本研究的RNA-Seq 分析結果顯示5 組有刺和無刺材料比較組的DEG 共同顯著富集的KEGG 通路是“類黃酮生物合成”“二萜生物合成”“苯丙烷生物合成”和“芪類、二芳基庚烷和姜辣素生物合成”。類黃酮生物合成通路中的26 個DEG 在ThoCK vs. TleCK 組的有刺材料中表達上調，說明這些基因可能響應高Suc 促進黑杞枝刺發生。注釋到二萜生物合成通路的共同DEG（GA3ox1），在5 個比較組的無刺材料中均上調，該DEG 與赤霉素合成有關，說明赤霉素可能響應低Suc 抑制黑杞枝刺發生。注釋到該通路的四甲基十六碳四烯醇合酶基因（GES）的表達情況則正好相反，在5 個比較組的無刺材料中均下調，說明該基因可能響應高Suc 促進黑杞枝刺發生。單獨或者聯合GA3ox1 高表達、GES 低表達（或敲除）有望用于培育無刺黑杞。苯丙烷類合成可產生大量的次生代謝產物，如木質素[37]。注釋到苯丙烷生物合成通路的共有DEG（LFAP）在4 個比較組的無刺材料中表達上調，其注釋為木質素形成陰離子過氧化物酶，可催化木質素合成。說明低Suc 可能通過加速木質素合成來抑制黑杞枝刺發生，木質素含量應該與枝刺發生負相關。綜上，推測本研究的黑杞無性系枝刺發生可能與高類黃酮、低木質素積累和低赤霉素合成量，以及相關基因的表達水平有關；且這些基因的表達可能均受Suc 的調控。

轉錄因子作為轉錄激活因子或抑制因子[38]，在植物細胞代謝、器官構成及環境應答等多種生物學過程中發揮重要作用[39]。Zhang 等[40] 發現WRKY 轉錄因子在茄子Solanum melongena L. 皮刺的發育過程中特異性上調。薔薇Rosa multiflora中NAC 和WRKY 等幾個與次生代謝相關轉錄因子在皮刺中表達上調[36]。本研究Venn 圖中33 個共有差異轉錄因子中的NAC 和WRKY 類轉錄因子較多，NAC 轉錄因子基因在5 個比較組的無刺材料中均上調，而WRKY 轉錄因子基因則均下調，由此我們推測低Suc 可能通過下調WRKY、上調NAC 轉錄因子來抑制黑杞枝刺發生。聯合或者單獨上調轉錄因子NAC 表達、降低WRKY 表達（或者敲除）有望培育出無刺或少刺黑果枸杞。目前亦無NAC 和WRKY 轉錄因子影響植物枝刺的報道。這些推測性結論仍需進行轉基因實驗來驗證。TCP 轉錄因子由于其廣泛參與調控植物的生長發育過程和多種激素信號轉導途徑而備受關注[41]。本研究中，RNA-Seq 結果發現3 個關鍵比較組2個共同的DEG，被預測為TCP 轉錄因子家族，且在無刺樣品中均下調。這提示我們2 個TCP 轉錄因子的低表達或者敲除有望用于培育無刺黑杞。前人研究發現柑橘兩個TCP 類轉錄因子基因TI1和TI2 成功編輯之后產生的ti1 突變體、ti2 突變體和ti1 ti2 雙突變體，三種突變體分別導致超10%、約6% 和幾乎每根枝刺向側枝轉變[19]。這也再次證明本研究發現的兩個TCP 基因的低表達或者敲除可用于培育無刺或者少刺黑杞。

植物激素是植物感受外部環境變化、調節自身生長狀態、抵御不良環境及維持生存必不可少的信號分子[42]，在植物的生長過程中發揮著重要作用，促進植物生命活動正常進行[43]。本研究發現，4 個有刺和無刺比較組的DEG 顯著富集在植物激素信號轉導KEGG 通路。5 組比較組共有的196個DEG 中3 個分別注釋到此通路的茉莉酸、生長素和水楊酸的信號通路。其中水楊酸相關（PR-1）和生長素相關（SAUR）DEG 的在各類無刺樣品表達上調，茉莉酸相關DEG（JAZ）則表達下調。這說明生長素、茉莉酸、水楊酸可能響應Suc 含量變化影響黑杞枝刺發生；單獨或者聯合通過調控JAZ 低表達、PR-1 和SAUR 高表達很可能達到有效抑制黑杞枝刺發生的效果。另外，本課題組研究發現外源生長素IAA 處理可以抑制黑杞枝刺發生，水楊酸含量與其枝刺發生也呈負相關[18]。前人研究發現水楊酸和茉莉酸對植物防御起關鍵作用[44-45]，枝刺也屬于植物的防御性器官[16]。這說明Suc 可能通過低表達SAUR 介導的低IAA 信號來促進黑杞枝刺發生，低Suc 通過高表達SAUR介導的高IAA 信號來抑制黑杞枝刺發生；水楊酸和PR-1 可能具有類似的機制，而茉莉酸及JAZ 也可能參與了Suc 影響黑杞枝刺發生事件。

葉綠體差異表達基因分析顯示有刺和無刺材料（頂芽）之間的cpDEG 主要參與光合作用、葉綠體基因的轉錄和翻譯。本研究中有刺黑杞枝條單簇葉片數量顯著高于無刺枝條。葉片是光合作用的器官，數量較多的葉片使植物總體光合作用增強。較無刺頂芽（TleCK），有刺頂芽（ThoCK）光合作用KEGG 通路9 個差異基因有8 個表達上調，證明葉片發育原始階段，有刺材料的光合強度可能已經顯著強于無刺材料。多葉片導致的總體光合作用增強和頂芽光合作用KEGG通路上調，極可能是有刺頂芽Suc（光合產物）含量顯著高于無刺頂芽的原因。9 個差異基因包括4 個cpDEG和5 個細胞核DEG，這也提示我們頂芽細胞核和葉綠體基因的表達調控共同決定了黑杞枝刺的發育和有無。細胞核和葉綠體基因的表達存在交互調控，可能涉及細胞核到葉綠體的順行信號和葉綠體到細胞核的逆行信號[46]。有研究發現基因表達調控影響光合作用，進而影響植物的生長發育[47]。因此，推測基因表達和光合作用的差異引起的Suc 含量差異影響了黑杞刺原基的發育進而導致黑杞出現有刺和無刺兩種類型的植株。但是，按照本研究的分析方法，增施外源Suc 后無刺變有刺材料和減少內源Suc 后有刺變無刺材料與相應對照之間的cpDEG，與有刺和無刺對照之間的cpDEG 并無重疊。這說明增施外源或者減少內源Suc 的處理并非簡單通過逆轉葉綠體相關cpDEG的表達來達到逆轉刺表型的目的，這種表型逆轉可能存在更加復雜的機制。增施外源Suc 后無刺變有刺材料（ThoSuc）的光合作用KEGG 通路有2 個葉綠體基因和1 個細胞核基因表達下調，說明外源Suc 處理后內源Suc 的增加可能會使黑杞頂芽光合作用適當減弱。增施外源Suc 的處理除了顯著促進黑杞枝刺發生，還顯著增加了新發枝條單簇的葉片數量。這證明雖然外源Suc 處理可能并沒有使頂芽光合作用增強，但是增加的葉片數量會使整個植株的光合作用增強，進而導致更多的Suc 運輸到頂芽。rpoC2 表達葉綠體RNA 聚合酶PEP 的β″ 亞基[48]，其在TheCK vs. ThoSuc 表達下調可能預示著只含有PEP 類啟動子的葉綠體基因表達也會隨之下調[49]。但是本研究僅檢測到另外2 個光合作用相關基因psaB、petB 在ThoSuc表達顯著下調。這提示我們這2 個光合葉綠體基因可能只含有PEP 類啟動子，而不含NEP 類啟動子[50]。參照前人的研究[24-25]，我們采用黑暗聯合去葉處理來降低有刺黑杞的內源Suc 含量。結果顯示黑暗聯合去葉顯著降低了黑杞新發莖的枝刺發生，甚至使其完全無刺。與有刺對照相比，黑暗去葉處理后無刺枝條頂芽只有一個注釋到光合作用KEGG 通路的葉綠體基因表達顯著下調，另外還有兩個葉綠體核糖體蛋白基因表達顯著變化（表3），這說明黑暗聯合去葉處理抑制枝刺發生可能與光合作用以及葉綠體蛋白翻譯有關。綜上所述，我們建立Suc 影響黑杞枝刺發生的機理模型（圖7）：多葉高光合或者外源Suc 處理導致的頂芽高Suc，通過圖中路徑促進黑杞枝刺發生；反之，少葉低光合或者去葉導致的頂芽低Suc，則抑制黑杞枝刺發生。本研究屬于上游性研究，要最終揭示Suc 影響黑果枸杞枝刺發生機理，還有大量工作需要進行。課題組目前正在進行黑果枸杞的穩定遺傳轉化，已經獲得幾個基因的穩定轉化株系。今后我們將在本研究發現的基礎之上，繼續開展單基因或者多基因的聯合轉化實驗。另外，內源Suc 以及各類激素的測定也需要繼續開展。

3.2 結 論

本研究通過RNA-Seq 發現黑杞5 個有刺和無刺比較組DEG 共同顯著富集在9 個GO 條目和4個KEGG 通路，共有196 個DEG，其中較多轉錄因子基因被預測為NAC 和WRKY 家族。5 組比較組有3 個共有DEG 注釋在植物激素信號轉導KEGG 通路，分別參與生長素、茉莉酸和水楊酸信號傳導。3 個關鍵比較組共有2 個DEG 被預測為TCP 轉錄因子基因，同時均有cpDEG 被注釋到光合作用KEGG 通路。本研究建立了Suc 影響黑杞枝刺發生的機制模型，為揭示更深層次的黑杞枝刺發生機理和培育其無刺優良品種奠定了基礎。

參考文獻：

[1] GAO Y， WANG Q M， AN Q X， et al. A novel micropropagationof Lycium ruthenicum and epigenetic fidelity assessment of threetypes of micropropagated plants in vitro and ex vitro[J]. PLoSONE，2021，16（2）：e0247666-e0247666.

[2] CHEN S S， ZENG Z， HU N， et al. Simultaneous optimizationof the ultrasound-assisted extraction for phenolic compoundscontent and antioxidant activity of Lycium ruthenicum Murr.fruit using response surface methodology[J]. Food Chemistry，2018，242：1-8.

[3] LI Y， HE X M， YUAN H F， et al. Differed growth stage dynamics ofroot-associated bacterial and fungal community structure associatedwith halophytic plant Lycium ruthenicum[J]. Microorganisoms，2022，10（8）：1644-1644.

[4] BAO X M， GAN X L， FAN G H， et al. Transcriptome analysisidentifies key genes involved in anthocyanin biosynthesis in blackand purple fruits （Lycium ruthenicum Murr. L）[J]. Biotechnology amp;Biotechnological Equipment，2022，36（1）：553-560.

[5] LU Y Y， KONG X F， ZHANG J H， et al. Composition changes inLycium ruthenicum fruit dried by different methods[J]. Frontiersin Nutrition，2021，8：737521-737521.

[6] 武雪玲， 李筱筱， 戴雪伶， 等. 黑果枸杞提取物活性的研究進展[J]. 生命的化學，2017，37（5）：761-766.

WU X L， LI X X， DAI X L， et al. Research progress of extractionfrom Lycium ruthenicum Murr. in biological activity[J].Chemistry of Life，2017，37（5）：761-766.

[7] CHEN S S， HU N， WANG H L， et al. Bioactivity-guidedisolation of the major anthocyanin from Lycium ruthenicumMurr. fruit and its antioxidant activity and neuroprotective effectsin vitro and in vivo[J]. Food amp; Function，2022，13（6）：3247-3257.

[8] PENG Y J， DONG W， CHEN G J， et al. Anthocyanins fromLycium ruthenicum Murray ameliorated high-fructose dietinducedneuroinflammation through the promotion of the integrityof the intestinal barrier and the proliferation of lactobacillus[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2023，71（6）：2864-2882.

[9] CHEN S S， ZHOU H N， ZHANG G， et al. Anthocyanins fromLycium ruthenicum Murr. ameliorated D-galactose-inducedmemory impairment， oxidative stress， and neuroinflammationin adult rats[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2019，67（11）：3140-3149.

[10] CHEN S S， WANG H L and HU N. Long-term dietary Lyciumruthenicum Murr. anthocyanins intake alleviated oxidative stressmediatedaging-related liver injury and abnormal amino acidmetabolism[J]. Foods，2022，11（21）：3377-3377.

[11] LIU P， LI W R， HU Z Z， et al. Isolation， purification， identification，and stability of anthocyanins from Lycium ruthenicum Murr[J].LWT- Food Science and Technology，2020，126 （prepublish）：109334-109334.

[12] 李強， 何彩， 史星雲， 等. 不同種源黑果枸杞果實游離氨基酸的品質評價[J]. 經濟林研究，2023，41（1）：26-35.

LI Q， HE C， SHI X Y， et al. Quality evaluation of free aminoacids in fruits for different provenances of Lycium ruthenicum[J].Non-wood Forest Research，2023，41（1）：26-35.

[13] YUN D W， YAN Y M and LIU J. Isolation， structure andbiological activity of polysaccharides from the fruits of Lyciumruthenicum Murr： A review[J]. Carbohydrate Polymers，2022，291：119618-119618.

[14] WANG H Q， LI J N， TAO W W， et al. Lycium ruthenicumstudies： molecular biology， phytochemistry and pharmacology[J].Food Chemistry，2018，240：759-766.

[15] 武延生， 嚴文培， 張曉麗， 等. 植物刺的類型與功能辨析[J].生物學通報，2021，56（4）：13-15.

WU Y S， YAN W P， ZHANG X L， et al. Analysis on the typesand functions of plant thorns[J]. Bulletin of Biology，2021，56（4）：13-15.

[16] YANG A L， QI X Y， WANG Q M， et al. The branch-thornoccurrence of Lycium ruthenicum is associated with leaf DNAhypermethylation in response to soil water content[J]. MolecularBiology Reports，2021，1-10.

[17] 齊新宇. 黑果枸杞LrSUS 對枝刺發生的影響及其可能機理[D]. 沈陽： 沈陽農業大學，2022.

QI X Y. Effect of Lycium ruthenicum LrSUS on the occurrenceof branch thorn and its possible mechanism[D]. Shenyang：Shenyang Agricultural University，2022.

[18] 王欽美， 劉雯， 喬楊， 等. 吲哚乙酸在培育無刺黑果枸杞方面的應用：CN114303766B[P].2023-08-04.

WANG Q M， LIU W， QIAO Y， et al. Application of indoleaceticacid in the cultivation of Lycium ruthenicum： CN114303766B[P].2023-08-04.

[19] ZHANG F， ROSSIGNOL P， HUANG T B， et al. Reprogrammingof stem cell activity to convert thorns into branches[J]. CurrentBiology，2020，PP：2951-2961.e5.

[20] ZHANG F， WANG Y W， IRISH V F. CENTRORADIALISmaintains shoot meristem indeterminacy by antagonizingTHORN IDENTITY1 in citrus[J]. Current Biology，2021，31（10）：2237-2242.e4.

[21] LI L J， QIAO Y， QI X Y， et al. Sucrose promotes branch-thornoccurrence of Lycium ruthenicum through dual effects of energyand signal[J]. Tree Physiology，2023，43（7）：1187-1200.

[22] LIU J Q， LYU M X， XU X X， et al. Exogenous sucrose promotesthe growth of apple rootstocks under high nitrate supply bymodulating carbon and nitrogen metabolism[J]. Plant Physiologyand Biochemistry，2022，192：196-206.

[23] JIAN Y， WU G L， ZHOU D H， et al. Effects of shading oncarbohydrates of syzygium samarangense[J]. Notulae BotanicaeHorti Agrobotanici Cluj-napoca，2019，47（4）：1252-1257.

[24] 沙建川， 王芬， 賈志航， 等. 葉果比和摘葉方式對蘋果13C同化物向果實轉運及果實品質的影響[J]. 植物生理學報，2020，56（1）：93-100.

SHA J C， WANG F， JIA Z H， et al. Effect of leaf-fruit ratio andleaf-picking methods on translocation of 13C-photoassimilatesto fruit and fruit quality in apple[J]. Plant Physiology Journal，2020，56（1）：93-100.

[25] KASAI M. Regulation of leaf photosynthetic rate correlatingwith leaf carbohydrate status and activation state of Rubiscounder a variety of photosynthetic source/sink balances[J].Physiologia Plantarum，2008，134（1）：216-226.

[26] DEWEY C N， LI B. RSEM： accurate transcript quantificationfrom RNA-Seq data with or without a reference genome[J]. BMCBioinformatics，2011，12（1）：323.

[27] WANG L K， FENG Z X， WANG X， et al. DEGseq： an R packagefor identifying differentially expressed genes from RNA-seqdata[J]. Bioinformatics （Oxford， England），2010，26（1）：136-8.

[28] MA X H， ZHOU Q， HU Q D， et al. Effects of different irradianceconditions on photosynthetic activity， photosystem Ⅱ ， rubiscoenzyme activity， chloroplast ultrastructure， and chloroplast-relatedgene expression in Clematis tientaiensis leaves[J]. Horticulturae，2023，9（1）：118-118.

[29] WANG Q M， CUI J G， DAI H Y， et al. Comparative transcriptomeprofiling of genes and pathways involved in leaf-patterning ofClivia miniata var. variegata[J]. Gene，2018，677：280-288.

[30] 鄭祎. 基于高通量測序探索彩葉君子蘭條紋葉形成機理[D].沈陽： 沈陽農業大學.2020.

ZHENG Y. Exploring the formation mechanism of stripedleaves of Clivia miniata var. variegata based on high-throughputsequencin[D]. Shenyang： Shenyang Agricultural University，2020.

[31] JUAN G， ESTELA R. Spine production is induced by fire：a natural experiment with three Berberiss pecies[J]. ActaOecologica，2004，26：239-245.

[32] MICHAL R， HAVIVA M， SIMCHA L Y. Quantitativecharacterization of the thorn system of the common shrubsSarcopoterium spinosum and Calicotome villosa[J]. IsraelJournal of Plant Sciences，2007，55（1）：63-72.

[33] SHATRUJEET P， RIDHI G， ARCHANA B， et al. Transcriptomeanalysis provides insight into prickle development and its link todefense and secondary metabolism in Solanum viarum Dunal[J].Scientific Reports，2018，8（1）：1-12.

[34] SWARNKAR M K， KUMAR P， DOGRA V， et al. Pricklemorphogenesis in rose is coupled with secondary metaboliteaccumulation and governed by canonical MBW transcriptionalcomplex[J]. Plant Direct，2021，5（6）：e00325-e00325.

[35] XIAO F， ZHAO Y， WANG X R， et al. Comparative transcriptomeanalysis of Gleditsia sinensis thorns at different stages ofdevelopment[J]. Plants，2023，12（7）：1456.

[36] ZHANG Y， ZHAO M J， ZHU W， et al. Nonglandular prickleformation is associated with development and secondarymetabolism related genes in Rosa multiflora[J]. Physiologia Plantarum，2021，173（3）：1147-1162.

[37] THOMAS V. Phenylpropanoid biosynthesis[J]. MolecularPlant，2010，3（1）：2-20.

[38] SEO E， CHOI D. Functional studies of transcription factorsinvolved in plant defenses in the genomics era[J]. Briefings inFunctional Genomics，2015，14（4）：260-7.

[39] 李芳蕊， 許思佳， 劉霽廣， 等. 轉BpTCP10 基因抑制表達白樺的耐鹽性分析[J]. 中南林業科技大學學報，2022，42（3）：16-25+38.

LI F R， XU S J， LIU J G， et al. Salt tolerance analysis oftransgenic Betula platyphylla seedlings with inhibited BpTCP10expression[J]. Journal of Central South University of Forestry amp;Technology，2022，42（3）：16-25，38.

[40] ZHANG L， SUN H Y， XU T， et al. Comparative transcriptomeanalysis reveals key genes and pathways involved in prickledevelopment in Eggplant[J]. Genes，2021，12（3）：341-341.

[41] 馮志娟， 徐盛春， 劉娜， 等. 植物TCP 轉錄因子的作用機理及其應用研究進展[J]. 植物遺傳資源學報，2018，19（1）：112-121.

FENG Z J， XU S C， LIU N， et al. Molecular mechanisms andapplications of TCP transcription factors in plants[J]. Journal ofPlant Genetic Resources，2018，19（1）：112-121.

[42] 資麗媛， 林浴霞， 傅若楠， 等. 植物激素轉運研究進展[J]. 植物生理學報，2022，58（12）：2238-2252.

ZI L Y， LIN Y X， FU R N， et al. Research progress in planthormones transport[J]. Plant Physiology Journal，2022，58（12）：2238-2252.

[43] 王鎵鋇， 李文瑩， 葛暢， 等. 外源激素對‘ 葡萄桐’ 雄樹開花性狀及果實特性的影響[J]. 中南林業科技大學學報，2023，43（4）：20-32，110.

WANG J B， LI W Y， GE C， et al. Effects of exogenous hormoneson the flowering and fruit characteristics of male tunotrees of‘putaotong’ （Vernicia fordii Hemsl.）[J]. Journal of Central SouthUniversity of Forestry amp; Technology，2023，43（4）：20-32，110.

[44] MOHD S， QAZI F， TIBOR J. Multifaceted role of salicylic acidin combating cold stress in plants： a review[J]. Journal of PlantGrowth Regulation，2020，40 （prepublish）：1-22.

[45] WANG J， SONG L， GONG X， et al. Functions of jasmonic acidin plant regulation and response to abiotic stress[J]. InternationalJournal of Molecular Sciences，2020，21（4）：1446-1446.

[46] OH S， MONTGOMERY B L. Phytochrome-dependent coordinatecontrol of distinct aspects of nuclear and plastid gene expressionduring anterograde signaling and photomorphogenesis[J].Frontiers in Plant Science，2014，5：171.

[47] LI Y， YU C， MO R L， et al. Screening and verification ofphotosynthesis and chloroplast-related genes in Mulberry bycomparative RNA-Seq and virus-induced gene silencing[J].International Journal of Molecular Sciences，2022，23（15）：8620-8620.

[48] CHEN Z， SCHERTZ K F， MULLET J E， et al. Characterizationand expression of rpoC2 in CMS and fertile lines of sorghum[J].Plant Molecular Biology，1995，28：799-809.

[49] LEGEN J， KEMP S， KRAUSE K， et al. Comparative analysis ofplastid transcription profiles of entire plastid chromosomes fromtobacco attributed to wild-type and PEP-deficient transcriptionmachineries[J]. The Plant Journal： for Cell and MolecularBiology，2022，31（2）：171-188.

[50] LERBS-MACHE S. Function of plastid sigma factors in higherplants： regulation of gene expression or just preservation ofconstitutive transcription？[J]. Plant molecular biology，2011，76（3-5）：235-249.

[ 本文編校：趙 坤]

基金項目：國家自然科學基金項目（32171831）；遼寧省自然科學基金項目（2023-MS-207）。