不同梨種質資源對火疫病菌的抗性評價

摘 要：【目的】梨火疫病是一種危害梨樹且具有毀滅性的細菌性病害，傳播速度快、傳播途徑廣、危害性極大、防治難度高。了解國內外梨種質資源對梨火疫病的抗病性水平并進行抗性評價，為挖掘梨火疫病抗病資源、抗病基因和選育抗病品種提供科學依據。【方法】采用離體枝條人工接種鑒定技術，對90 個梨種質資源的1 年生離體枝條進行火疫病強致病力菌株接種，觀察枝條、葉片的病變特征，通過比較接種病原菌后不同梨種質資源枝條的發病率和病情指數，制定梨種質資源抗病性評價指標，綜合評價供試梨種質資源的抗病水平。【結果】梨火疫病菌株對供試的90 個梨種質資源枝條均具有不同程度的致病力，90 個梨種質資源對梨火疫病菌的抗性水平存在明顯差異，發病率為20% ～ 100%，野山梨的發病率最低（20%），75.56% 的資源發病率為100%，病情指數為8.89 ～ 100，安梨的病情指數最低（8.89），寒香的病情指數最高（100）；供試的90 個梨種質資源的抗病水平普遍較低，在其中未發現有高抗品種，抗病品種只有2 個，占2.22%；中抗品種8 個，占8.89%。抗性種質的遺傳背景表現為東方梨＞西洋梨。【結論】安梨、龍園香、龍園洋紅、甘梨早6、八月紅、晉蜜梨、早酥、粉酪、寒紅、碩豐梨這10 個梨種質資源對梨火疫病具有較好的抗性，可作為梨抗火疫病育種的資源。本研究結果可為梨火疫病抗病育種及相關抗病基因的挖掘等提供參考。

關鍵詞：梨；種質資源；火疫病；抗病性；評價

中圖分類號：S661.2 文獻標志碼：A 文章編號：1003—8981（2024）01—0107—09

梨火疫病是由解淀粉歐文氏菌Erwinia amylovora引起的一種具有毀滅性的細菌性病害，能侵染多種薔薇科植物[1]，2012 年被列入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》，2020 年被列入中國《一類農作物病蟲害名錄》，是我國進境植物檢疫性有害生物。該病傳播速度快、傳播途徑廣、危害性極大、防治難度大。近距離傳播主要通過昆蟲、氣流、水流、鳥、修剪工具及果農的田間農事操作，同時病菌也可通過樹體傷口（機械傷、蟲傷、冰雹傷或農事操作、嫁接等造成的傷口）、自然孔口（氣孔、蜜腺、柱頭、皮孔）等侵入寄主組織傳播，遠距離傳播主要是調運種苗、接穗、砧木、花粉過程以及候鳥等的傳帶。植株感染梨火疫病菌后可出現花腐、果腐、枝條枯萎、菌膿等癥狀[2]，后期造成樹勢衰弱、枝干死亡、樹體殘缺不全，嚴重者整株死亡甚至毀園。2015 年該病首次在新疆伊犁地區霍城縣發生，目前新疆14 個地州均有發生[3]，對新疆的特色林果業造成了嚴重經濟損失，阻礙了新疆特色林果產業的健康發展。

加強植物檢疫、選育抗病品種和砧木、優化農事操作，同時結合采用化學藥劑和生物防治技術是防治梨火疫病的主要措施。而抗病品種的篩選和培育是當前最有效的長期防治手段[4]。前人研究認為，抗火疫病基因的遺傳和積累對后代的抗性水平有顯著影響[5]。我國是梨屬植物的起源地，擁有類型豐富的梨種質資源，資源的抗病性鑒定是抗病育種的基礎。李洪濤等[1] 采用離體枝條接種強致病力火疫病菌株對20 個梨品種（種質）抗病性進行了鑒定，結果表明僅有2 個品種表現出抗病性，4 個品種表現耐病性，其他均為感病品種。陳勵坤等[4] 分別采用嫩葉、嫩枝針刺接菌和幼果半果接菌法對31 個新疆梨品種的抗病水平進行了鑒定，結果表明供試梨品種抗火疫病水平整體偏低。劉華威等[6] 采用幼果人工接種鑒定技術對54份梨的種質資源進行了梨火疫病抗性評價，認為在中國梨種質中可能存在較豐富的抗梨火疫病資源。段紅雁等[7] 采用離體枝條接種法和梨幼果針刺接種法比較了5 種薔薇科果樹對梨火疫病的抗性，發現杜梨和庫爾勒香梨抗性最差。作為梨火疫病發生的風險區域，有必要充分了解國內外梨種質資源對梨火疫病的抗病性水平。本研究以引進保存和自主選育的90 個梨種質資源為試材，采用優化的離體枝條浸漬接種法，比較不同梨種質資源接種病菌后的枝條發病率和病情指數，制定梨品種（類型）的抗病性評價指標，綜合評估供試梨品種（類型）的抗病水平，從而為構建挖掘梨火疫病抗病資源和抗病基因以及抗病品種的選育提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試90 個梨的種質資源均采自新疆生產建設兵團第二師農業科學研究所梨種質資源圃，為國內外引進保存及自主選育而來，圃內土、肥、水管理水平一致。90 個梨的種質資源信息見表1。

供試菌株為梨火疫病菌Erwinia amylovora（編號E.a Y01），菌株分離于新疆伊寧市，寄主為梨，屬于強致病力菌株，由南京農業大學植物保護學院胡白石教授惠贈。

1.2 方 法

試驗于2021 年7 月進行。采集各品種健康梨樹的1 年生幼嫩枝條，基部用浸水的無菌脫脂棉包裹，再用保鮮膜包扎保濕后帶回實驗室備用。

1.2.1 病原菌的活化及接種液的制備

將供試菌株接種于LB 培養基上，28℃培養36 h 活化。挑取單菌落于LB 液體培養基中，于28℃、220 r/min 條件下振蕩培養，培養成OD600值為1.4 左右的菌液，然后吸取5 ml 加入到三角瓶中，再加入無菌水稀釋成OD600 值為0.2 的菌液作為接種液。

1.2.2 離體枝條接種

將枝條截成30 cm 的枝段，每個枝段上端保留有1 ～ 3 片健康完整無破損的葉片。用75% 酒精做表面消毒后，枝段下端切口留斜口，插入盛有接種液的三角瓶中浸漬接種，每個品種接種3 組，每組5 根枝條。對照為無菌液的無菌水，其他培養條件相同。接種后放置于溫度28℃、相對濕度75%、光照12 h 的室內。

1.2.3 病原菌鑒定

接種后第7 d 感病枝條均表現出黑褐色病變的典型特征，證明該菌株為火疫病的病原菌，同時對該病原菌進行分離、培養，結果發現，該病原菌與接種菌在菌落形態上完全一致，表明導致枝條病變的致病菌為接種菌。

1.2.4 病情統計

接種后第7 d 測定統計發病枝條數、發病枝條病斑長度、病斑長度占接種枝條長度的比例及發病級別。參照李洪濤等[1]、李曉妹等[3] 的研究方法，制定梨火疫病病菌接種梨離體枝條的病情分級標準：0 級，枝條無病斑；Ⅰ級，枝條病斑長度占接種枝條長度的1.0% ～ 5.0%；Ⅲ級，枝條病斑長度占接種枝條長度的5.1% ～ 15.0%；Ⅴ級，枝條病斑長度占接種枝條長度的15.1% ～ 30.0%；Ⅶ級，枝條病斑長度占接種枝條長度的30.1% ～50.0%；Ⅸ級，枝條病斑長度占接種枝條長度的50.1% 以上。

根據下列公式計算枝條的發病率、離體枝條接種后相同時間的病情指數。

發病率=（發病枝條數/ 接種總枝條數）×100%

病情指數（DI）=[Σ（各級發病枝條數× 病級代表值）/（接種總枝條數× 最高病級代表值）]×100

1.2.5 不同梨種質資源對梨火疫病菌株的抗病性評價

統計不同梨種質資源接種后的發病枝條數、測量枝條病斑長度，計算發病率、病情指數，制定梨種質資源抗病性評價指標，綜合評價供試梨種質資源的抗火疫病水平。參考李洪濤等[1]、李曉妹等[3] 的研究結果及《梨種質資源描述規范和數據標準》[8] 的抗病性分級指標，制定資源抗病性劃分標準：高抗（HR），病情指數≤ 5.0；抗病（R），病情指數5.1 ～ 15.0；中抗（MR），病情指數15.1 ～ 30.0；中感（MS），病情指數為30.1 ～ 40.0；感病（S），病情指數為40.1 ～ 50.0；高感（HS），病情指數≥ 50.1。

1.3 數據分析

采用Excel 軟件對試驗數據進行整理、分析并繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 不同梨種質資源對梨火疫病的抗性

不同梨種質資源枝條接種梨火疫病菌后的發病情況見表2。由表2 可知，供試火疫病菌株對供試的90 個梨種質資源均有不同程度的致病力。供試梨種質資源枝條接種梨火疫病菌后發病率為20% ～ 100%。其中，野山梨的發病率最低，為20%， 龍園洋紅、晉蜜梨、甘梨早6、龍園香4 個梨種質資源的發病率中等，分別為50%、50%、50% 和57.14%，中梨1 號（綠寶石）、早酥蜜、早酥、紅香酥、新梨8 號、世紀無核梨、碩豐梨、華蜜、紅梨2 號、寒酥、八月紅、早酥紅、紅茄梨、中矮1 號、安梨、茬梨（萊陽慈梨）和艾溫切克17 個梨種質資源的發病率較高，在75% ～ 91.67% 之間，其他68 個梨種質資源的發病率均為100%，占總數的75.56%。

供試梨種質資源枝條接種梨火疫病菌后病情指數為8.89 ～ 100。其中安梨的病情指數最低，為8.89；龍園香（9.52），甘梨早6（16.67）、八月紅（20.37）、晉蜜梨（20.37）、早酥（22.22）、粉酪（23.81）、寒紅（25.93）、碩豐梨（26.67）的病情指數相對較低；蔗梨、秋月、玉露香、杭青、黃冠、寒香、翠冠、Tosca、甘泉、大香水（大頭黃）、隰縣甜梨、晚玉、懋功梨、庫爾勒香梨和原平紅15 個梨種質資源的病情指數較高，均在70以上；其中寒香的病情指數最高，達到100；其次為Tosca，為92.59。

2.2 不同梨種質資源對梨火疫病的抗性水平

供試90 個梨種質資源離體枝條接種梨火疫病菌后葉片、枝條出現黑褐色病變，刮開韌皮部后的癥狀表現見圖1。從圖1 可以看出，接種后枝條木質部呈黑褐色病變，不同梨種質資源病斑的長度不同，說明不同梨種質資源的抗病能力差異較大。

不同梨種質資源對梨火疫病的抗性水平見表3。由表3 可知，供試的90 個梨種質資源間的抗病水平普遍較低。其中未發現有高抗品種，抗病品種有2 個，分別是安梨和龍園香，僅占測定總數的2.22%。中抗品種有8 個，分別為龍園洋紅、甘梨早6、八月紅、晉蜜梨、早酥、粉酪、寒紅和碩豐梨，占測定總數量的8.89%。中感品種有13 個，如中梨1 號（綠寶石）、早酥紅、南紅梨等，占測定總數的14.44%。感病品種有18 個，如新梨7 號、茬梨、三季梨、滿天紅等，占測定總數的20%。高感品種有49 個，占測定總數的54.44%。高感品種中目前國內主栽品種較多，其中本地主栽品種庫爾勒香梨為高感品種，常用授粉樹碭山酥梨和鴨梨也為高感品種，近年來栽培規模逐漸擴大的玉露香也為高感品種。

供試90 個梨種質資源中有白梨21 個、砂梨18 個、秋子梨7 個、新疆梨3 個、西洋梨5 個、種間雜交梨36 個。抗性種質（包含高抗、抗病、中抗）占各種類百分比從高到低依次為：種間雜交梨19.44%、西洋梨16.67%、秋子梨14.29%、白梨4.76%、砂梨0%、新疆梨0%。可推測，國內外豐富多樣的梨種質資源不管歸屬于哪個種類，均有80% 以上的資源對火疫病的抗性水平不容樂觀。供試90 個梨種質資源中遺傳背景明確的資源有87 個（僅龍園洋、龍園香和冬蜜除外），將遺傳背景結合感抗病類型分析可知，抗性種質（包含高抗、抗病、中抗）的遺傳背景表現為東方梨＞西洋梨（圖2）。

3 結論與討論

3.1 結 論

供試梨火疫病菌對90 個梨種質資源均有不同程度的致病力。供試梨種質資源枝條接種梨火疫病菌后發病率為20% ～ 100%，病情指數為8.89 ～ 100。供試梨種質資源的抗病水平普遍較低，未發現高抗品種，安梨和龍園香梨為抗病品種，龍園洋紅、甘梨早6、八月紅、晉蜜梨、早酥、粉酪、寒紅、碩豐梨為中抗品種。不同梨種質資源的抗病能力差異較大，抗性種質的遺傳背景表現為東方梨＞西洋梨。

3.2 討 論

致病性的測定作為一種快速有效的檢測方法在資源抗性評價中得到廣泛應用。該方法將分離得到的病原菌接種到植物的幼苗、嫩梢、葉片、花、果實等進行癥狀觀測與評價，具有直觀、方便、快捷、實用、高效的優點。在抗性評價方法上，大多采用統計發病枝條數占接種總枝條數的百分比（發病率）、發病枝條枯死病斑長度占接種枝條長度的比例對寄主抗/ 感病性進行分級[9]。國外在抗火疫病梨品種選育和應用等方面已開展了不少研究。Bell 等[10] 通過田間抗病性調查和人工接種試驗的綜合分析，表明在東方梨中有品種對梨火疫病具有抗病性，并已經培育出抗火疫病的‘Shenandoah’梨新品種。Laux 等[11] 篩選出2個抗火疫病的梨屬變種。Sillerova 等[12] 培育出了高抗火疫病的梨新品種‘Bohemica’。國內研究人員圍繞梨種質資源的抗病性評價中初步篩選出了一些抗病資源材料。陳勵坤等[4] 通過嫩葉、嫩枝針刺接菌和半果接菌對31 個新疆梨品種的抗火疫病水平進行了評價，發現31 個梨品種的抗火疫病水平整體偏低，棉梨、也力克阿木特和綠梨可作為抗病育種材料優先考慮。劉華威等[6] 對54 份梨種質資源對梨火疫病的抗性評價發現，來自中國的46 份梨種質中有37 份種質表現出抗病，來自其他國家的8 份梨種質僅有1 份表現抗病，認為東方梨的抗性較西洋梨更強，在梨的地方品種中蘊藏著良好的抗病性。李洪濤等[1] 對我國20 個梨品種（種質）抗火疫病的研究發現，晉酥、綠梨表現抗病性，霍城冬黃梨、八月酥、庫車阿木特、棉梨表現出耐病性，這6 個品種均為我國的地方品種。

本研究對引進保存及自主選育的90 個梨種質資源采用優化的浸漬法接種火疫病菌后的發病率和病情指數調查統計發現，供試的所有梨種質資源均表現出發病癥狀，不同資源發病程度不同，發病率在20%～ 100%之間，病情指數在8.89 ～ 100之間。其中野山梨的發病率最低為20%，病情指數為33.33，病情指數最小的品種為安梨（8.89），發病率高達80%，這2 個資源均屬于秋子梨系統，南果梨、大香水也屬于秋子梨，發病率均為100%，病情指數分別為50.11、70.37，說明同一系統的梨種質資源并不是都對火疫病具有良好的抗性，不同品種間也存在一定的差異。供試的90個梨種質資源中，僅有10 個梨種質資源抗病，占測定總數量的11.11%，80 個梨種質資源不同程度的感病，占測定總量的88.89%。供試90 個梨種質資源中沒有具有垂直抗性的品種，鑒定出的抗病和中抗品種可能對所有火疫病菌生理小種具有良好的田間抗性，即水平抗性。庫爾勒香梨、秋月、鴨梨、碭山酥梨、翠冠、黃冠、玉露香、南果梨、紅香酥等品種高度感病，茬梨、早生黃金、滿天紅、新梨7 號、三季梨等品種感病，其中不少都是目前國內主栽的優良品種，說明現有主栽品種對火疫病的抗性水平不容樂觀，新的抗火疫病梨品種的選育仍然是育種的重要方向。

陳勵坤等[4] 研究發現庫爾勒香梨、艾溫切克屬于中感品種，李洪濤等[1] 研究表明，庫爾勒香梨、碭山梨屬于高感品種，晉酥屬于抗病品種，雪花梨、杜梨、紅香酥、早酥、新梨7 號屬于感病品種，而劉華威等[6] 的研究則發現龍香、蘋香、懋功、碭山酥梨屬于抗病品種，庫爾勒香梨、蘋果梨、慈梨屬于感病品種。前人的研究結果之間也不盡相同，個別品種與本研究也不一致。分析認為影響因素主要有以下3 點：一是所用材料不同，所用病原菌的致病力可能存在差異，采用的離體葉片、枝條、果實對火疫病菌的敏感程度也不一致；二是病害分級標準不同，鑒定方法不同，導致抗性級別的劃分也不盡相同；三是感病程度與環境、樹齡、采樣時期以及樹體營養狀況有一定關系，一般來說幼嫩和生長旺盛的組織比成熟的、生長緩慢的組織更容易感病，施用更多氮肥的植株更易感病，發病速度隨著植株的生長速度降低會減緩。因此，今后的研究中可在條件一致的水平下考慮盆栽苗、組培苗等活體接種，結合離體鑒定結果，試驗結果會更加真實、可靠。

前人研究表明火疫病抗性受基因控制，為多基因遺傳，母本遺傳效應高于父本，但植株抗火疫病的表型在很大程度上受到環境變化的影響[13]，將高抗基因遺傳積累是雜交育種培育抗病材料的整體思路。本研究鑒定出抗性較好的安梨、龍園香、龍園洋紅、甘梨早6、八月紅、晉蜜梨、早酥、粉酪、寒紅、碩豐梨10 個梨種質資源，為抗梨火疫病遺傳育種的研究奠定了材料基礎，這10 個種質的抗性機制及抗性位點的等位性有待進一步研究。從遺傳背景上分析，抗性種質的抗性水平表現為東方梨＞西洋梨，東方梨中可能存在更多的抗火疫病資源，對我國豐富的梨種質資源來說，抗火疫病資源仍有待進一步挖掘。尤其是野生種質，其經過長期自然選擇，種內變異豐富，優異種質較多[14]，更需要進行深入挖掘。目前，梨火疫病的防治主要是依靠化學防治和物理措施，生物防治技術的應用還較少。有研究表明，植物細菌性病害的發生和發展與內生菌群結構的改變密切相關[15]，而拮抗菌的篩選是生物防治的基礎性工作[16]。因此，在進一步發掘和培育抗病種質的基礎上，需要加強生物防治技術的研究與應用，從而為梨火疫病的綠色防控提供技術支撐。

參考文獻：

[1] 李洪濤， 張靜文， 盛強， 等. 我國20 個梨品種（ 種質） 對國外梨火疫病菌的抗病性評價[J]. 果樹學報，2019，36（5）：629-637.

LI H T， ZHANG J W， SHENG Q， et al. Resistance evaluationof 20 pear varieties （germplasms） in China to foreign strainsof Erwinia amylovora[J]. Journal of Fruit Science，2019，36（5）：629-637.

[2] 魯晏宏， 郝金輝， 羅明， 等. 梨火疫病拮抗菌篩選及溫室防效測定[J]. 微生物學通報，2021，48（10）：3690-3699.

LU Y H， HAO J H， LUO M， et al. Screening of antagonisticbacteria against Erwinia amylovora and its control effect ingreenhouse[J]. Microbiology China，2021，48（10）：3690-3699.

[3] 李曉妹， 韓麗麗， 何亞南， 等.20 個蘋果品種（ 類型） 對梨火疫病菌的抗病性評價[J]. 植物檢疫，2022，36（4）：6-12.

LI X M， HAN L L， HE Y N， et al. Evaluation on the resistanceof 20 apple varieties to Erwinia amylovora[J]. Plant Quarantine，2022，36（4）：6-12.

[4] 陳勵坤， 徐葉挺， 王永鵬， 等. 新疆梨種質資源的火疫病抗性評價[J]. 中國果樹，2022（8）：16-22.

CHEN L K， XU Y T， WANG Y P， et al. Evaluation on fire blightresistance of Pyrus sinkiangensis Yu germplasm resources[J].China Fruits，2022（8）：16-22.

[5] KELLERHALS M， SCHüTZ S， PATOCCHI A. Breeding forhost resistance to fire blight[J]. Journal of Plant Pathology，2017，99：37-43.

[6] 劉華威， 王曉鳴， 郭慶元， 等. 梨種質對梨火疫病的抗性研究[J]. 植物遺傳資源學報，2008，9（2）：195-200.

LIU H W， WANG X M， GUO Q Y， et al. Identification ofresistance to fire blight in pear germplasm[J]. Journal of PlantGenetic Resources，2008，9（2）：195-200.

[7] 段紅雁， 李紫英， 王蘭， 等.5 種薔薇科果樹對梨火疫病的抗性[J]. 中國果樹，2022（2）：65-67，74.

DUAN H Y， LI Z Y， WANG L， et al. Resistance of 5 Rosaceaefruit trees to pear fire blight[J]. China Fruits，2022（2）：65-67，74.

[8] 曹玉芬， 劉鳳之， 胡紅菊， 等. 梨種質資源描述規范和數據標準[M]. 北京： 中國農業出版社，2006：85-88.

CAO Y F， LIU F Z， HU H J， et al. Descriptors and data standardfor pear （Pyrus spp.）[M]. Beijing： China Agriculture Press，2006：85-88.

[9] KORBA J， ?ILLEROVá J， K?DELA V. Resistance of applevarieties and selections to Erwinia amylovora in the CzechRepublic[J]. Plant Protection Science，2008，44（3）：91-96.

[10] BELL R L， ZWET T V D ， MILLER D D. ‘Shenandoah’： a newfire blight resistant pear cultivar[J]. HortScience，2004，39（4）：805.[11] LAUX P， ZELLER W. Fire blight resistance in extensive pomefruit production in Germany[J]. Acta Horticulturae，2006，704：531-534.

[12] SILLEROVA J， KORBA J， PAPRSTEIN F， et al. Testing ofresistance of pear cultivars after artificial inoculation with Erwiniaamylovora in field conditions[J]. Acta Horticulturae，2011，896：353-355.

[13] EVRENOSO?LU Y， MERTO?LU K， BILGIN N A， et al.Inheritance pattern of fire blight resistance in pear[J]. ScientiaHorticulturae，2019，246：887-892.

[14] 李永濤， 王振猛， 楊慶山， 等. 山東省6 個豆梨野生群體的遺傳多樣性分析[J]. 中南林業科技大學學報，2022，42（1）：138-145.

LI Y T， WANG Z M， YANG Q S， et al. Genetic diversity analysison six wild populations of Pyrus calleryana from Shandongprovince[J]. Journal of Central South University of Forestry amp;Technology，2022，42（1）：138-145.

[15] 鐘雅婷， 鄒東霞， 廖旺姣， 等. 輪斑病導致的桉樹葉片內生真菌群落結構差異分析[J]. 中南林業科技大學學報，2022，42（4）：68-75.

ZHONG Y T， ZOU D X， LIAO W J， et al. Differential analysis ofcommunity structure of endophytic fungi in the eucalyptus leavesinfected by Coniella Eucalyptorum[J]. Journal of Central SouthUniversity of Forestry amp; Technology，2022，42（4）：68-75.

[16] 楊蕊， 肖月， 李萍， 等. 澳洲堅果葉部病害病原菌鑒定及其生防菌篩選[J]. 經濟林研究，2023，41（1）：282-291.

YANG R， XIAO Y， LI P， et al. Identification of pathogens of leafdiseases of Macadamia integrifolia and screening of antagonisticfungi[J]. Non-wood Forest Research，2023，41（1）：282-291.

[ 本文編校：趙 坤]

基金項目：新疆維吾爾自治區“天山英才”培養計劃項目；兵團財政科技計劃項目（2022CB005-01，2023AB004-03）；第二師鐵門關市科技計劃資助（2021NYGG01）。