冷脅迫下普通油茶CCCH 型鋅指蛋白基因家族的鑒定和分析

摘 要：【目的】為挖掘和利用耐寒普通油茶Camellia oleifera 遺傳資源提供參考。【方法】基于普通油茶的冷脅迫轉錄組數據，對其CCCH 型鋅指蛋白基因進行鑒定，并對CCCH 型鋅指蛋白進行理化性質分析、系統發育分析、保守結構域預測、二級結構預測等相關生物信息學分析，并以廬山高海拔油茶（LSG）和栽培油茶品種贛無1（GW1）為材料，對CCCH 型鋅指蛋白基因在冷脅迫下的表達情況進行分析。【結果】在普通油茶的冷脅迫轉錄組數據中共鑒定到24 個CCCH 型鋅指蛋白基因，參考水稻分類方法，將24 個CCCH 型鋅指蛋白聚類到2 個亞家族中。保守基序分析結果表明，在24 個基因中僅有3 種CCCH 型鋅指蛋白基序類型，即C-X8-C-X5-CX3-H、C-X7-C-X5-C-X3-H 和C-X5-C-X4-C-X3-H，數目分別為92、4 和4。轉錄組表達譜分析結果表明：在野外冷脅迫試驗中CoC3H17 基因在D4、D5 和D6 時期的表達量高于D1、D2 和D3 時期，在室內冷脅迫試驗中廬山高海拔油茶和贛無1 的CoC3H17 基因一直表現為更高的轉錄本豐度；CoC3H14 和CoC3H24 基因在野外試驗的D4、D5 和D6 時期均表現為表達量明顯上升，且在室內冷脅迫試驗中廬山高海拔油茶的這2 個基因的表達量高于贛無1。【結論】CoC3H17、CoC3H14 和CoC3H24 基因可能是普通油茶應對冷脅迫的關鍵基因。

關鍵詞：普通油茶；CCCH 型鋅指蛋白基因家族；生物信息學分析；冷脅迫；轉錄組

中圖分類號：S602.4 文獻標志碼：A 文章編號：1003—8981（2024）01—0011—09

普通油茶Camellia oleifera 當前栽種面積超過433 萬hm2，是我國產量最大的木本油料作物[1-3]。油茶籽油中富含以油酸和亞油酸為主的不飽和脂肪酸，有良好的保健功能，其營養價值可以和橄欖油媲美，是一種優質的食用植物油[4-11]。普通油茶通常于秋冬季開花結果，易受低溫脅迫的影響，由于溫度的限制主要分布于我國長江流域及其以南的亞熱帶低山丘陵地區[12-18]。廬山高海拔地區的野生普通油茶能在-30 ℃的條件下生存，是抗寒育種的寶貴遺傳資源[19]。Xie 等[19] 對不同時期廬山高海拔地區普通油茶葉片進行了比較轉錄組分析，結果表明flg22、Ca2+ 和赤霉素信號轉導途徑以及木質素生物合成途徑的關鍵基因可能參與了普通油茶對冷脅迫的響應。

CCCH 型鋅指蛋白是一類含有3 個半胱氨酸（Cys）和1 個組氨酸（His）鋅指結構域的轉錄因子，根據半胱氨酸和組氨酸殘基之間氨基酸間隔區的數量，將CCCH 基序的一致性序列定義為C-X4-17-C-X4-6-C-X3-4-H（C 代表半胱氨酸，H代表組氨酸，X 代表任意氨基酸）[20]。到目前為止，CCCH 型鋅指蛋白家族已經在擬南芥Arabidopsis thaliana、水稻Oryza sativa、玉米Zea mays、白菜Brassicarapa 等植物中被鑒定[21-24]。研究結果表明，CCCH型鋅指蛋白在植物響應冷脅迫反應中發揮重要作用。鋅指蛋白SIC3H39 基因負調控番茄的耐冷性[25]；在低溫處理過程中，柳枝稷轉基因株系的鋅指蛋白PvC3H72 基因的表達量顯著上調[26]；在菊花Chrysanthemum morifolium 中過表達鋅指蛋白DgC3H1 基因可以提高其對冷脅迫的抗性[27]；過表達鋅指蛋白AtTZF1 基因的擬南芥植株在耐冷性方面優于野生型[28]。

Xie 等[19] 的研究結果在轉錄組層面揭示了普通油茶耐寒的部分分子機制，然而，關于CCCH型鋅指蛋白基因在普通油茶響應冷脅迫過程中的作用尚缺乏足夠的研究。為了給普通油茶良種選育相關工作提供參考，本研究中擬在已測定的轉錄組數據中鑒定CCCH 型鋅指蛋白基因家族，并對其進行理化性質分析、保守結構域預測、蛋白質二級結構預測等相關生物信息學分析。同時，補充分析普通油茶廬山耐寒種群在響應冷脅迫過程中CCCH 型鋅指蛋白家族成員的表達模式。

1 材料與方法

1.1 普通油茶CCCH 型鋅指蛋白基因家族的鑒定

試驗材料為六倍體普通油茶，其冷脅迫轉錄組數據由本團隊經測序獲得（NCBI SRA 登錄號為PRJNA915196）[19]。從擬南芥基因組數據庫網站（https：//www.arabidopsis.org/）和水稻基因組數據庫網站（http：//rice.uga.edu/）下載CCCH 蛋白序列。將擬南芥和水稻的CCCH 蛋白序列作為查詢序列，使用BLASTP 程序以1×10-10 的E 值作為閾值，搜索普通油茶蛋白質數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA915196）。利用HMMER3.0 程序中的hmmbuild 命令，構建CCCH蛋白的隱馬爾科夫模型，并以此來搜索普通油茶蛋白質數據庫。將HMMER 與BlASTP 搜索結果進行對比，并通過人工編輯的方式進行篩選。利用Cdhit軟件去除預測同源蛋白的冗余序列。接著利用PFAM 數據庫（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/）、NCBI-CDD 數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi） 和SMART 數據庫（http：//smart.embl-heidelberg.de/）進一步鑒定，去除沒有CCCH 結構域的序列，最終確定普通油茶CCCH 型鋅指蛋白基因家族成員[21]。

1.2 普通油茶CCCH 型鋅指蛋白的生物信息學分析

利用Expasy 的在線工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）， 預測CCCH 型鋅指蛋白的基本理化性質，包括氨基酸數量、相對分子質量、理論等電點、不穩定指數、脂肪指數和平均疏水指數等理化性質指標[22]。利用在線工具SOPMA（https：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma. html） 預測蛋白質的二級結構。利用在線工具Soft Berry Prot Comp9.0（http：//www.softberry.com/ berry.phtml？topic=protcompplamp;group=programsamp;subgroup=proloc）預測CCCH 型鋅指蛋白的亞細胞定位。通過在線工具TM-HMMServer 2.0（https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM）預測CCCH 型鋅指蛋白的跨膜區。通過在線工具MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）檢測普通油茶CCCH 型鋅指蛋白的保守結構域，最大主題數量設為10，其他可選參數設置為默認值[21]。使用TBtools 軟件進行結果可視化[29]。

1.3 普通油茶CCCH 型鋅指蛋白家族的系統發育分析

基于水稻和普通油茶CCCH 型鋅指蛋白家族成員的全長氨基酸序列，使用Clustalx 2.0 進行多重序列比對。根據比對結果，利用MEGA 7.0 軟件，采用Neighbor-Joining（NJ）方法構建系統發育樹，對普通油茶CCCH型鋅指蛋白家族進行亞家族分類[23]。

1.4 普通油茶CCCH 型鋅指蛋白基因家族冷脅迫下表達模式的驗證

為了驗證冷脅迫下CCCH 型鋅指蛋白基因家族的表達模式，設置了野外原位試驗及室內低溫模擬試驗。

野外原位試驗在江西省九江市廬山高海拔區域進行，選取該區域內3 株長勢健旺的普通油茶樹，標記為LSG1 ～ LSG3。在普通油茶經歷冷馴化后（氣溫降至10 ℃），從2020 年10 月16日到2021 年1 月2 日，選取了D1（13.4 ℃）、D2（16.3 ℃）、D3（11.3 ℃）、D4（4.7 ℃）、D5（6.6 ℃）、D6（1.6 ℃）共6 個時期的普通油茶葉片進行轉錄組測序。

室內低溫試驗也在經歷冷馴化后進行，以上述3 株廬山高海拔普通油茶以及3 株栽種在江西省林業科學院低海拔區域的栽培普通油茶贛無1（GW1）為樣樹。在同一采樣日，從2 個區域選定的樣樹上各采集12 片帶葉柄的新鮮未受損的葉片。使用去離子水清洗樹葉表面，用吸水紙擦干。同一樣樹的1 ～ 3 片樹葉被裝在1 個穿孔塑料拉鏈袋（120 mm×85 mm）中。對樣本進行預處理，將所有葉片全部放置在RXZ-0358-LED 型氣候箱（寧波江南儀器廠）中12 h，條件設置為4 ℃、黑暗條件。隨后將樣品分別放置在氣候箱中，在-10 ℃條件下處理0、1、3、6、16 和32 h，取出經冷凍處理的葉片，馬上用鋁箔覆蓋，并立即放置在裝有液氮的真空瓶中，然后保存在-80 ℃冰箱中，用于轉錄組測序[19]。

對測序后獲得的轉錄組數據進行分析，觀察經過不同處理后CCCH 型鋅指蛋白基因響應冷脅迫的表達模式。使用TBtools 軟件進行表達數據分析、聚類和展示。表達譜熱圖是使用log2（x+1） 轉換的每1 000 個堿基的轉錄每百萬映射讀取的片段（fragments per kilobase of exon model per millionmapped reads，FPKM）值生成的[29]。

2 結果與分析

2.1 普通油茶CCCH 型鋅指蛋白的理化性質

通過蛋白質同源性搜索，共鑒定到24 條具有完整CCCH 型鋅指結構的序列。為便于研究，將24 個基因進行統一命名（CoC3H1 ～ CoC3H24），其所編碼蛋白的編號為CoC3H1 ～ CoC3H24。利用Expasy 的在線工具ProtParam 對24 個基因編碼的CCCH 型鋅指蛋白的理化性質進行分析，結果見表1。結果表明：24 個CCCH 型鋅指蛋白的氨基酸數量為191（CoC3H16）～ 736（CoC3H17）；預測的理論相對分子量質量為21 364.31 Da（CoC3H16）～ 80 232.83 Da（CoC3H17）；理論等電點為4.7（CoC3H13） ～ 9.1（CoC3H21），其中有8 個CCCH 型鋅指蛋白的等電點小于7，呈酸性，其余16 個CCCH 型鋅指蛋白呈堿性；僅CoC3H16 的不穩定指數小于40，為穩定蛋白，其余23 個CCCH型鋅指蛋白的不穩定指數大于40，為不穩定蛋白；脂肪指數為41.77（CoC3H5）～ 75.01（CoC3H23）；平均疏水指數為-1.063 ～ -0.313，證明這24 個CCCH 型鋅指蛋白均為親水性蛋白。

亞細胞定位預測結果表明，在這24 個CCCH型鋅指蛋白中，多數成員定位于細胞核，僅有2 個蛋白的亞細胞定位在細胞外，且這24 個蛋白均無跨膜區。SMART 在線工具檢測結果表明：普通油茶CCCH 型鋅指蛋白家族中，CCCH 基序的數量為2 ～ 5；CoC3H12、CoC3H14、CoC3H17、CoC3H23 這4 個成員僅有2 個CCCH 基序， 占總成員數量的16.7%；CoC3H6、CoC3H16、CoC3H18這3 個成員各有3 個CCCH 基序，占比12.5%；CoC3H10、CoC3H13、CoC3H21、CoC3H22 這4 個成員各有4 個基序，占比16.7%；具有5 個基序的成員數量最多，有13 個，占比54.1%（表1）。

2.2 普通油茶CCCH 型鋅指蛋白的亞家族分類

為了研究普通油茶中CCCH 型鋅指蛋白家族特性，將比對鑒定出來的24 個基因進行系統發育分析。參照模式植物水稻的分類方法，將普通油茶中24 個CCCH 型鋅指蛋白家族全部聚類到2 個亞家族中（Bootstrap 值大于50%），如圖1 所示，即Ⅰ類亞家族和Ⅲ類亞家族。其中Ⅲ類亞家族最大，包含20 個CCCH 型鋅指蛋白，剩余4 個家族成員位于Ⅰ類亞家族。經進一步分析發現，在Ⅰ類亞家族中的蛋白全部包含2 個CCCH 基序，在Ⅲ類亞家族中的蛋白包含3 ～ 5 個CCCH 基序（圖1 和表1）。

2.3 普通油茶CCCH 型鋅指蛋白的結構

從基序類型來看，24 個CCCH 型鋅指蛋白僅有3 種CCCH 基序類型， 即C-X8-C-X5-C-X3-H、C-X7-C-X5-C-X3-H 和C-X5-C-X4-C-X3-H， 數目分別為92、4 和4（圖2）。預測普通油茶CCCH 型鋅指蛋白中含有10 個保守基序（motif），不同CCCH 型鋅指蛋白家族成員所包含的基序類型不同，同一分支的CCCH 型鋅指蛋白家族成員具有相同或相似的基序組合，表明CCCH 型鋅指蛋白在亞家族內存在功能分化，但在成員間高度保守（圖3）。其中CoC3H12、CoC3H17、CoC3H14、CoC3H23 的基序類型最為簡單且均只含有基序6、基序7、基序9。在CCCH 型鋅指蛋白家族中，基序1 和基序2 出現頻率較高，分別出現20、21 次，說明基序1 和基序2 保守基序可能是普通油茶CCCH 型鋅指蛋白家族的重要基序類型（圖3）。保守結構域分析結果表明，CCCH 型鋅指蛋白還攜帶其他幾種已知的功能性結構域，包括Ank、PHA等（圖3）。10 個保守基序的詳細序列如圖4 所示。

普通油茶CCCH 型鋅指蛋白的基序在同組內相似，在不同組間存在差異。經進一步研究發現，位于Ⅰ類亞家族的4 個家族成員僅含有基序6，基序7 和基序9，且基序類型均為C-X7-C-X5-C-X3-H和C-X5-C-X4-C-X3-H，位于Ⅲ類亞家族的20 個家族成員含有3 ～ 5 個基序，且基序類型均為C-X8-C-X5-C-X3-H，與系統發育分析結果一致。

2.4 普通油茶CCCH 型鋅指蛋白的二級結構

利用SOPMA 分析工具預測普通油茶CCCH型鋅指蛋白的二級結構，發現CCCH 型鋅指蛋白中無規則卷曲占83.48% ～ 55.87%，α- 螺旋占32.22% ～ 2.89%，β- 轉角占6.17% ～ 2.59%， 延伸鏈占17.99% ～ 7.93%（表2）。

2.5 普通油茶CCCH 型鋅指蛋白基因響應冷脅迫的表達譜

分析結果表明，54.17% 的CCCH 型鋅指蛋白基因家族成員在LSG 和GW1 中均表現為較低的轉錄本豐度（FPKM 值小于5）。CoC3H17 基因在野外冷脅迫試驗的D4、D5 和D6 時期的表達量高于D1、D2 和D3 時期，在室內冷脅迫試驗的LSG 和GW1 中一直表現為更高的轉錄本豐度。CoC3H14和CoC3H24 基因在野外試驗的D4、D5 和D6 時期均表現為表達量明顯上升，且在室內冷脅迫試驗的LSG 中的表達量高于在GW1 中的表達量。CoC3H4、CoC3H13 和CoC3H23 等基因在GW1 中的表達量顯著高于在LSG 中的表達量（圖5）。

3 結論與討論。

基于普通油茶響應冷脅迫過程中的轉錄組數據，本研究中鑒定到分屬2 個亞家族的24 個CCCH 型鋅指蛋白基因，其蛋白結構具有較高的保守性。其中，CoC3H17、CoC3H14 和CoC3H24等基因在響應冷脅迫過程中表現出顯著的差異表達量，可能是普通油茶應對冷脅迫的關鍵基因。

所鑒定24 個CCCH 型鋅指蛋白家族成員，僅被聚類為2 個亞家族分支。在擬南芥和水稻中分別鑒定到68 和67 個CCCH 家族成員[21]。六倍體普通油茶沒有因為染色體多倍化發生基因家族擴張，反而呈現收縮趨勢，這可能是因為在進化過程中CCCH 型鋅指蛋白家族發生過染色體水平的缺失，這種現象也曾在四倍體柳枝稷中觀察到[30]。另外，本研究中使用的是轉錄組數據，可能存在一些未表達基因家族成員未被鑒定到的情況。

普通油茶的CCCH 型鋅指蛋白具有較高的保守性。本研究中所有CCCH 型鋅指蛋白家族僅包含3 種基序類型，且同一亞家族蛋白質的保守基序較為相似。這3 種基序類型在擬南芥、水稻和玉米中也有報道，表明CCCH 型鋅指蛋白在不同的物種間也具有保守性[21-23]。

普通油茶CCCH 型鋅指蛋白基因家族約1/3的成員在冷脅迫過程中被激發，呈現較高的轉錄表達量。本研究的野外試驗設置在廬山高海拔區域，在試驗過程中D1—D3 時期氣溫均在10 ℃以上，D4 時期氣溫明顯下降（4.7 ℃），該時期CoC3H17 基因的表達豐度顯著提高。本研究室內試驗設置的溫度均在4 ℃以下，CoC3H17 基因一直持續高表達。這表明CoC3H17 基因可能在普通油茶響應冷脅迫過程中發揮著重要作用。通過進一步探究廬山耐寒種群（LSG）與栽培普通油茶（GW1）之間CCCH 型鋅指蛋白基因家族成員的差異，發現在野外試驗中2 個種群的CoC3H14和CoC3H24 基因在低溫階段（D4—D6）顯著提高了轉錄本表達量，在室內低溫試驗過程中，廬山耐寒種群在處理0 ～ 32 h 時持續高表達，且顯著高于栽培普通油茶。因此，推測CoC3H14 和CoC3H24 基因可能是廬山耐寒普通油茶特有的響應低溫脅迫的基因。

本研究中對普通油茶CCCH 型鋅指蛋白基因家族適應冷脅迫的功能基因進行了鑒定，而其在普通油茶生長發育、逆境信號響應等過程中的具體功能仍有待深入研究。同時，普通油茶CoC3H14和CoC3H24 基因響應冷脅迫的分子機制也是下一步研究的方向。

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[ 本文編校：聞 麗]

基金項目：國家自然科學基金項目（32260306，32270238）。