基于單細胞測序的草酸鈣腎結石大鼠髓袢細胞亞群基因表達譜特征分析

［摘要］ 目的： 探討草酸鈣腎結石大鼠模型腎臟組織髓袢細胞亞群基因表達譜特征。方法： 應用乙二醇氯化銨誘導法構建草酸鈣腎結石大鼠模型，通過Von Kossa′s組織染色驗證模型構建成功。單細胞測序方法鑒定髓袢細胞，對比分析草酸鈣腎結石大鼠模型腎臟組織髓袢細胞亞群基因表達譜特征，應用生物信息學方法進行差異表達基因的GO、KEGG以及GSEA富集分析。結果： 相較于對照組，實驗組大鼠腎臟組織中發現鈣鹽沉積區域呈黑色或棕黑色，表明草酸鈣腎結石大鼠模型構建成功。單細胞測序分析發現，在實驗組髓袢細胞亞群共有差異表達基因3 510個，其中880個表達上調，2 630個表達下調；其中LOC499584，白介素7（interleukin 7，Il7），雙特異性磷酸酶1（dual specificity phosphatase 1，Dusp1）以及基質Gla蛋白（matrix Gla protein，Mgp）表達上調最為顯著；HORMA結構域蛋白質2（HORMA domain containing 2，Hormad2），LOC361914，JUN二聚體蛋白2（Jun dimerization protein 2，Jdp2）以及生長抑素-B和血小板反應蛋白1型結構域蛋白（somatomedin-B and thrombospondin type-1 domain-containing protein，Sbspon）表達下調最為顯著。KEGG分析發現實驗組髓袢細胞亞群氧化磷酸化、代謝途徑、丙酸代謝、自噬、溶酶體以及胞吞作用等信號通路發生顯著改變。結論： 本研究首次揭示了草酸鈣腎結石大鼠模型腎臟組織髓袢細胞亞群基因表達譜特征，為腎結石的形成及其介導的腎損傷研究提供了一定的參考依據。

［關鍵詞］ 腎結石；單細胞測序；表達譜；髓袢；生物信息學

［中圖分類號］ R692.4

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 1671-7783（2024）02-0104-07

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230278

［引用格式］許婷，張穎，鄧瓊，等. 基于單細胞測序的草酸鈣腎結石大鼠髓袢細胞亞群基因表達譜特征分析［J］. 江蘇大學學報（醫學版）， 2024， 34（2）： 104-110.

The gene expression profiles of Henle-loop cell subset in renal tissue of the calcium oxalate kidney stone rat model based on single-cell sequencing analysis

XU Ting1， ZHANG Ying1， DENG Qiong1，2， LIANG Hui1， WANG Zhu1，2

（1. Department of Urology， 2. Central Laboratory， the People′s Hospital of Longhua Shenzhen， Shenzhen Guangdong 518110， China）

［Abstract］ Objective： To explore the gene expression profiles of Henle-loop cell subset in renal tissue of the calcium oxalate kidney stone rat model. Methods： The rat model of calcium oxalate kidney stone was constructed by ethylene glycol and 1% ammonium chloride. The model was validated by Von Kossa′s staining. Henle-loop cells were identified using single-cell sequencing method. The gene expression profiles of Henle-loop cell subsets in renal tissue of calcium oxalate kidney stone rat model were performed via comparative analysis. The enrichment analysis of differential genes was performed through GO， KEGG， and GSEA bioinformatics tools. Results： Compared with the control group， black or brownish black staining of calcium salt deposition were observed in the kidney tissue of the experimental group rats， indicating the successful construction of the calcium oxalate kidney stone rat model. Single cell sequencing analysis revealed that there was a total of 3 510 differentially expressed genes in the Henle-loop cell subset of the experimental group， of which 880 were upregulated and 2 630 were downregulated. LOC499584， Il7， dual specificity phosphatase 1 （Dusp1）， and matrix Gla protein （Mgp） were upregulated most significantly， while HORMA domain containing 2 （Hormad2）， LOC361914， Jun dimerization protein 2 （Jdp2）， and somatomedin-B and thrombospondin type-1 domain-containing protein （Sbspon） were downregulated most significantly. KEGG analysis revealed significant changes in signaling pathways such as oxidative phosphorylation， metabolism pathways， propanoate metabolism， autophagy， lysosome and endocytosis in the experimental group of Henle-loop cells. Conclusion： This study reveals for the first time the gene expression profile characteristics of Henle-loop cell subsets in renal tissue of the calcium oxalate kidney stone rat model， providing a molecular basis for the investigation of kidney stone formation and related kidney injury.

［Key words］ kidney stones; single cell sequencing; expression profile; Henle-loop; bioinformatics

髓袢（Henle-loop）是腎單位的U形部分，位于近曲小管和遠曲小管之間一個不均勻的節段，管徑細，管壁薄，起到吸收水分和鉀離子等的作用。早在1971年，研究人員就分別通過光學顯微鏡和透射電子顯微鏡發現在人體腎臟間質中的鈣化均發生在髓袢的基底膜并延伸至髓質間質［1-4］。隨后Stoller等［5］對尸體腎臟進行高分辨率放射照相研究，發現57%的腎臟有上皮Randall′s斑塊，證實了早期關于髓袢基底膜參與Randall′s斑塊發展的報道。

目前關于腎結石形成的機制主要有“自由粒子”和“固定粒子”兩種學說［6-7］。“自由粒子”機制學說認為高草酸尿癥或高鈣尿癥導致尿液過飽和促進了腎小管腔中草酸鈣或磷酸鈣晶體的形成，晶體滯留在尿流受阻的部位、近端小管與髓袢相連接部或腎小管彎曲的乳頭基底部。“固定粒子”機制學說則認為，結石形成始于磷酸鈣晶體在腎間質中髓袢基底膜形成的Randall′s斑塊，繼而大量特發性草酸鈣晶體進一步附著在Randall′s斑塊上從而導致腎結石的形成［7］。由此可見髓袢結構在腎結石形成過程中發揮著關鍵作用，但是具體機制尚不明確。

草酸鈣結石是五種腎結石里最為常見的一種，大量研究表明骨橋蛋白（osteopontin，Opn）、CC趨化因子配體2（Ccl2）、前列腺素E2（Pge2）、基質Gla蛋白（matrix Gla protein，Mgp）、α-1微球蛋白（alpha-1-microglobulin，Ambp）、骨連蛋白（也稱為Sparc）和CD44等在草酸鈣誘導的腎結石大鼠的腎上皮細胞中表達上調［8-10］，但是草酸鈣晶體對髓袢細胞亞群基因表達譜的影響尚未清楚。本研究在單細胞測序基礎上，對比分析草酸鈣腎結石大鼠模型中髓袢細胞亞群基因表達譜特征，為揭示髓袢中差異表達基因在腎結石形成過程中的分子機制研究提供一定的理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 乙二醇氯化銨誘導法建立草酸鈣腎結石大鼠模型

Sprague-Dawley大鼠（6周齡雄性）20只在無特定病原體動物設施中適應1周，可自由獲取無菌水和標準食物，保持室溫25 ℃，12 h的黑暗和光照循環。所有大鼠單獨飼養以保證相同的耗水量。動物研究按照倫理程序進行，大鼠隨機分為對照組和實驗組，每組10只。對照組大鼠灌胃2 mL/kg無菌水；參考先前報道［11-12］，實驗組大鼠每天額外補充1%（v/v）乙二醇的飲用水，加1%氯化銨1 mL灌胃。4周后，用過量麻醉法對大鼠實施安樂死。將一部分腎組織液氮速凍，一部分10%甲醛固定并包埋在石蠟中用于后續實驗。

1.2 Von Kossa′s染色檢測大鼠腎臟組織中的鈣鹽沉積

Von Kossa′s染色技術是利用金屬離子置換反應檢測組織中鈣鹽沉積，方法參考先前文獻報道［11］。首先將石蠟切片脫蠟至水，滴加硝酸銀溶液，用紫外燈連續照射2～3 h，蒸餾水洗多遍。然后切片入蘇木素染液染3～5 min，自來水洗，分化液分化，自來水洗，返藍液返藍，流水沖洗。用85%、95%的乙醇梯度脫水各5 min，入伊紅染液5 min。最后將切片依次放入無水乙醇Ⅰ 5 min無水乙醇Ⅱ 5 min無水乙醇Ⅲ 5 min二甲苯Ⅰ 5 min二甲苯Ⅱ 5 min透明，中性樹膠封片。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。鈣鹽沉積區域呈黑色或棕黑色，細胞核呈藍色，背景呈紅色。

1.3 單細胞測序及髓袢細胞亞群鑒定

分別從實驗組和對照組大鼠模型腎臟組織中分離單個細胞，使用密度梯度離心分離上述樣品的細胞核，重懸于細胞核洗滌緩沖液中，通過40 μm細胞濾網過濾，并進行細胞計數。使用10×Genomics Chromium平臺生成乳液中的單細胞凝膠珠（Gel Bead-in-Emulsion，GEM），用于逆轉錄過程以創建cDNA，然后對該cDNA進行擴增并用于測序［11］。按照制造商的說明，將每個樣品約10 000個細胞核加載到單細胞3′芯片（V3，10×Genomics）中。使用硅烷磁珠（10×Genomics，PN-2000048）從GEM后反應混合物中去除剩余的生化試劑和引物。聚合酶鏈式反應（PCR）擴增后，使用SPRIselect試劑盒（Beckman-Colter B23318）清理cDNA。cDNA質量控制和定量在安捷倫生物分析儀高靈敏度芯片上進行。ABI StepOnePlus實時PCR系統（Life Technologies）用于定量分析和匯集。根據Novaseq 6000的PE150模式進行測序。使用cell ranger（10×Genomics，3.0.2版）處理原始測序數據，并與大鼠參考基因組（Ensembl_release100。Rnor_6.0）比對。使用singleR對所有細胞進行注釋，并通過髓袢特異性標志物尿類黏蛋白（uromucoid，Umod）、溶質載體蛋白12A1（solute carrier family 12 member 1，Slc12a1）和跨膜蛋白72（transmembrane protein 72，Tmem72）進行細胞鑒定。

1.4 實驗組和對照組髓袢細胞差異基因的統計分析

基于細胞所屬的亞群信息和樣本信息，使用Seurat軟件對細胞進行組間差異分析，設置log2（FC）≥0.36、任意一組中表達目標基因的細胞比例≥0.1為閾值，使用MAST障礙模型檢驗差異顯著性。通過Seurat的BH法對差異基因的顯著性P值進行多重檢驗矯正，篩選矯正后P值≤0.05的基因作為顯著差異基因，得到顯著差異基因結果表，用于后續分布情況和富集分析。根據每個細胞亞群得到的上調基因數和下調基因數進行統計，獲得差異基因統計表并依此繪制差異基因統計圖。

1.5 差異表達基因的GO及KEGG分析

將實驗組大鼠模型腎臟髓袢細胞亞群差異表達基因向Gene Ontology（簡稱GO）數據庫（http：//www.geneontology.org/）的各條目映射，并計算每個條目的基因數，從而得到具有某個GO功能的基因列表及基因數目統計。然后應用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，在基因中顯著富集的GO條目。KEGG顯著性富集分析以KEGG信號通路為單位，應用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，在基因中顯著性富集的信號通路。通過信號通路顯著性富集能確定基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。

1.6 差異表達基因的GSEA分析

將草酸鈣腎結石大鼠模型腎臟髓袢細胞亞群差異基因進行GSEA（Gene Set Enrichment Analysis，https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）即基因集富集分析，分別計算富集分數、估計富集分數顯著性水平和矯正多重假設驗證。通過富集得分（enrichment score，ES）的動態曲線來描述和比較各個基因集的分析結果，ES最高（gt;0時）或最低（lt;0時）值為該基因集的ES值。P值是對ES值的統計學分析，用來表示富集結果的可信度。FDR（1 discovery rate）是錯誤發現率，即歸一化的ES代表假陽性結果的估計概率；標準化ES的絕對值越大FDR越小，FDR越小說明富集越顯著。

1.7 統計學分析

應用SPSS 17.0軟件進行統計分析。實驗組和對照組樣本之間的差異比較采用t檢驗，Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 草酸鈣腎結石大鼠模型腎臟組織髓袢細胞亞群的分離鑒定

通過Von Kossa′s染色驗證草酸鈣腎結石大鼠模型腎臟組織中的鈣鹽沉積，結果顯示，在實驗組大鼠腎臟組織中鈣鹽沉積區域呈黑色或棕黑色，而對照組則沒有明顯的褐色或黑色沉積，表明草酸鈣腎結石大鼠模型構建成功（圖1A）。單細胞核RNA測序，通過特異性標志物Umod、Slc12a1和Tmem72鑒定了髓袢細胞亞群（圖1B-C）。

2.2 草酸鈣腎結石大鼠模型髓袢細胞亞群差異基因的表達

對照組大鼠腎臟組織髓袢細胞亞群比例為15.16%，而在實驗組中占比10.63%（圖2A）。差異基因分析結果顯示，相對于對照組，實驗組大鼠腎臟組織髓袢細胞亞群差異基因共3 510個，其中880個上調表達，2 630個下調表達（圖2B）。LOC499584，Il7，Dusp1以及Mgp上調表達最為顯著（表1），Hormad2，LOC361914，Jdp2以及Sbspon下調表達最為顯著（表2）。

2.3 草酸鈣腎結石大鼠模型髓袢細胞亞群差異基因的GO及KEGG富集分析

GO分析發現，差異基因主要富集在代謝過程以及蛋白結合功能（圖3A）。KEGG富集分析發現差異基因主要參與氧化磷酸化、代謝途徑、丙酸代謝、自噬、溶酶體以及胞吞作用等信號通路（圖3B）。

2.4 草酸鈣腎結石大鼠模型髓袢細胞亞群差異基因GSEA分析

GSEA分析發現移植物抗宿主病，核糖體，1型糖尿病以及異體移植物排斥反應等通路顯著上調表達（圖4A）；氨酰基-tRNA生物合成，碳代謝，α-亞麻酸代謝，聚糖降解等通路顯著下調（圖4B）。

3 討論

髓袢細支的基底膜是磷酸鈣鈣鹽沉積介導Randall′s斑塊起源的部位，在腎結石形成過程中發揮關鍵作用［13］，但是其基因表達譜特征尚未清楚。本研究通過特異性標志物Umod、Slc12a1和Tmem72［14-15］鑒定了草酸鈣腎結石大鼠模型腎臟組織中的髓袢細胞亞群，并通過單細胞測序發現了草酸鈣腎結石大鼠模型腎臟組織髓袢細胞亞群差異基因表達譜特征，其中Il7在髓袢細胞中表達顯著上調。先前研究表明，細胞因子IL7及其受體IL7R對T細胞和小鼠B細胞的發育、原始T細胞的分化和存活以及記憶T細胞的產生和維持至關重要［16］，但其濃度升高與類風濕關節炎等自身免疫性疾病有關［17］。髓袢細胞中Il7的上調表達，可能是作為腎結石晶體介導的自身免疫反應的重要組成部分，在腎結石形成以及腎損傷過程中發揮作用，但是其作用機制仍有待進一步研究。Dusp1在維持線粒體功能和結構完整性方面起著關鍵作用，其表達上調是腎臟缺血再灌注損傷的重要防御保護機制［18］，因此Dusp1在草酸鈣腎結石大鼠模型髓袢細胞中的上調可能與腎損傷保護相關。

本研究結果還顯示Hormad2、LOC361914、Jdp2以及Sbspon在草酸鈣腎結石大鼠模型髓袢細胞中表達顯著下調。Hormad2與精子源性衰竭和自身免疫性腎小球腎炎有關［19］，但是其在髓袢以及腎結石形成中的功能和機制尚未有研究報道。Jdp2在體外和體內抑制p300介導的核心組蛋白乙酰化，抑制Jun家族蛋白介導的反式激活［20］，通過介導氧化應激信號誘導p16Ink4a和Arf表達，通過p16Ink4a-pRb和Arf-p53途徑導致細胞周期停滯［21］，在調控細胞衰老過程中發揮重要作用［22］。先前的研究大多關注近端腎小管細胞的Ca2+信號傳導通路改變、氧化損傷等因素在促進腎結石形成中的作用［8-10，23］。本研究采用單細胞測序技術聯合GO、KEGG以及GSEA富集分析發現草酸鈣腎結石大鼠模型中髓袢細胞氧化磷酸化、代謝途徑、丙酸代謝、自噬、溶酶體以及胞吞作用等信號通路顯著改變，為髓袢細胞在草酸鈣腎結石形成及其介導腎臟損傷的機制研究提供了一定的理論依據。

綜上所述，本研究通過單細胞測序成功鑒定分離了草酸鈣腎結石大鼠模型中髓袢細胞亞群，闡明了其基因表達譜特征，發現了在腎結石形成及其介導的腎損傷過程中的關鍵因子Il7、Dusp1以及Jdp2，為揭示髓袢細胞中腎結石形成相關信號通路提供了一定的參考依據。但是本研究主要是基于高通量技術以及生物信息學分析，仍有待在后續研究中通過細胞以及分子水平實驗進一步驗證。

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［收稿日期］ 2023-12-18" ［編輯］ 何承志

［基金項目］廣東省基礎與應用基礎研究基金（省企聯合，2022A1515220106）；廣東省醫學科學技術研究基金項目（A2023281）

［作者簡介］許婷（1983—），女，主管護師，主要從事泌尿系結石疾病研究；王鑄（通訊作者），副研究員，E-mail： wangzhu_1223@163.com