外源性硫化氫通過Wnt/β-catenin信號通路促進衰老BMSCs的成骨分化

［摘要］ 目的： 探討外源性硫化氫供體GYY4137對D-半乳糖（D-Gal）誘導的衰老骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成骨能力的影響及潛在機制。方法： 應用不同濃度的D-Gal誘導BMSCs的衰老，CCK8法檢測細胞活性及β-半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老的程度，確定D-Gal的最佳誘導濃度；應用不同濃度GYY4137進行干預后，檢測GYY4137對正常BMSCs及衰老BMSCs細胞活性的影響，確定GYY4137最佳干預濃度。實驗設CON組、GYY4137組、D-Gal組、D-Gal+GYY4137組，作相應處理后對各組BMSCs進行β-半乳糖苷酶染色，qRT-PCR法檢測衰老相關基因（P16、P21、P53）和衰老相關炎癥因子（IL-6、IL-8、TNF-α）的mRNA相對表達。對各組細胞進行成骨誘導分化，qRT-PCR法檢測成骨分化相關因子堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）、Runt相關轉錄因子2（RUNX2）、人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）的mRNA表達，通過茜素紅染色法檢測鈣結節(jié)形成數量，ALP染色法檢測ALP的生成。通過轉錄組測序檢測D-Gal組、D-Gal+GYY4137組兩組細胞的差異表達基因，根據測序結果，qRT-PCR對差異基因進行驗證。應用Dickkopf相關蛋白1（dickkopf Wnt signaling pathway inhibitor 1，DKK1）抑制Wnt10b的表達后，檢測各組衰老BMSCs的成骨分化能力。結果： D-Gal的最佳誘導濃度為30 g/L，GYY4137的最佳干預濃度為10 μmol/L，D-Gal組β-半乳糖苷酶陽性細胞比例顯著增加，衰老相關基因（P16、P21、P53）及衰老相關炎癥因子（IL-6、IL-8、TNF-α）mRNA的表達量顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），應用GYY4137干預后，以上細胞衰老相關指標顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。在成骨分化過程中，D-Gal+GYY4137組ALP、OCN、RUNX2、BMP2的mRNA表達，鈣結節(jié)陽性比例顯著高于D-Gal組（P＜0.05或P＜0.01）；測序結果發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路中的Wnt10b表達有顯著差異，qRT-PCR結果顯示GYY4137可增加衰老細胞Wnt10b及其下游基因β-catenin的表達（P＜0.05或P＜0.01），與測序結果一致。應用100 μg/L DKK1抑制Wnt10b的表達后，GYY4137處理的衰老BMSCs成骨分化相關基因ALP、OCN、RUNX2、BMP2的mRNA表達明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。結論： GYY4137可以緩解D-Gal誘導的BMSCs衰老進程，并且可能通過Wnt/β-cantenin信號通路促進衰老BMSCs的成骨分化。

［關鍵詞］ 骨髓間充質干細胞；細胞衰老；硫化氫供體；老年性骨質疏松；Wnt/β-catenin信號通路

［中圖分類號］ R329.2

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 1671-7783（2024）03-0234-08

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230269

［引用格式］范欽臣，何大偉，李翀. 外源性硫化氫通過Wnt/β-catenin信號通路促進衰老BMSCs的成骨分化［J］. 江蘇大學學報（醫(yī)學版）， 2024， 34（3）： 234-241.

Exogenous hydrogen sulfide promotes osteogenic differentiation of senescent BMSCs through Wnt/β-catenin signaling pathway

FAN Qinchen1， HE Dawei2， LI Chong3

（1. School of Medicine， Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu 212013; 2. Clinical Research amp; Lab Center， Kunshan Hospital Affiliated to Jiangsu University， Suzhou Jiangsu 215300; 3. Department of Spinal Surgery， Kunshan Hospital Affiliated to Jiangsu University，Suzhou Jiangsu 215300， China）

［Abstract］ Objective： To investigate the effect of exogenous hydrogen sulfide donor GYY4137 on the osteogenic ability of D-galactose （D-Gal）-induced senescent bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs）and its potential mechanism. Methods： BMSCs senescence was induced by different concentrations of D-Gal. The cell activity was detected by CCK8 method and the degree of cellular senescence was evaluated by β-galactosidase staining to choose the optimal concentration of D-Gal. After treatment with various concentrations of GYY4137， the effects of GYY4137 on the activity of normal BMSCs and senescent BMSCs were detected， and the optimal concentration of GYY4137 was determined. CON group， GYY4137 group， D-Gal group and D-Gal+GYY4137 group were set up， and β-galactosidase staining was performed on BMSCs in each group after corresponding treatment. The mRNA expression of cellular senescence-related genes （P16， P21， P53） and cellular senescence-related inflammatory factors （IL-6， IL-8， TNF-α） was detected by qRT-PCR. Osteoblastic induction differentiation was performed on cells in each group. mRNA expressions of osteogenic differentiation-related factors alkaline phosphatase （ALP）， osteocalcin （OCN）， Runt-related transcription factor 2 （RUNX2） and human bone morphogenetic protein 2 （BMP2） were detected by qRT-PCR. The number of calcium nodules formed was detected by alizarin red staining. ALP was detected by ALP staining. The differentially expressed genes of D-Gal group and D-Gal+GYY4137 group were detected by transcriptome sequencing. According to the sequencing results， the differentially expressed genes were verified by qRT-PCR. After the expression of Wnt10b was inhibited by DKK1， the osteogenic differentiation ability of senescent BMSCs in each group was detected. Results： The optimal induction concentration of D-Gal was 30 g/L， and the optimal intervention concentration of GYY4137 was 10 μmol/L. The β-galactosidase content in D-Gal group was significantly increased. The mRNA expression levels of senescence related genes （P16， P21， P53） and senescence related inflammatory factors （IL-6， IL-8， TNF-α） were significantly increased （Plt;0.05 or Plt;0.01）， and the above cell senescence related indicators were significantly decreased after GYY4137 intervention （Plt;0.05 or Plt;0.01）. During osteogenic differentiation， the mRNA expressions of ALP， OCN， RUNX2 and BMP2 in D-Gal+GYY4137 group were significantly higher than those in D-Gal group （Plt;0.05 or Plt;0.01）. The sequencing results showed that there were significant differences in Wnt10b expression in Wnt/β-catenin signaling pathway， and qRT-PCR results showed that GYY4137 increased the expression of Wnt10b and its downstream gene β-catenin in senescent cells （Plt;0.05 or Plt;0.01）， which was consistent with the sequencing results. The expression of Wnt10b was inhibited by 100 μg/L DKK1， and the mRNA expressions of ALP， OCN， RUNX2 and BMP2 related to osteogenic differentiation of senescent BMSCs treated with GYY4137 were significantly decreased （Plt;0.05 or Plt;0.01）. Conclusion： GYY4137 can alleviate the D-Gal-induced senescent process of BMSCs， and may promote osteogenic differentiation of senescent BMSCs through Wnt/β-cantenin signaling pathway.

［Key words］ bone marrow mesenchymal stem cells; cellular senescence; hydrogen sulfide donor; senile osteoporosis; Wnt/β-catenin signaling pathway

細胞衰老是老年性骨質疏松癥最常見的單一危險因素［1］。近年來，人們對“老年學假說”越來越感興趣，該假說認為，調控衰老的基本機制可以延緩許多慢性疾病的發(fā)生和（或）嚴重程度［2］。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種能促進骨和其他間充質組織再生的多能性細胞。隨著年齡增加，BMSCs的成骨功能下降，導致年齡相關的骨丟失。因此，恢復衰老BMSCs向成骨細胞分化的能力，是預防和治療老年性骨質疏松癥的關鍵。硫化氫（H2S）作為一種氣體信號分子，具有抗衰老的潛力［3-4］。然而H2S抗細胞衰老的作用及其機制，至今尚未完全闡明。有研究指出，Wnt/β-catenin信號通路在成骨過程中發(fā)揮著重要的作用［5］。因此，本實驗擬采用外源性H2S供體GYY4137處理BMSCs的衰老模型，探究GYY4137對衰老BMSCs成骨分化能力的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

BMSCs購自蘇州賽業(yè)生物有限公司；α-MEM、胎牛血清（美國Gibco公司）；GYY4137、D-半乳糖（D-Gal）、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶（0.25% Trypsin-EDTA）、磷酸鹽緩沖液（PBS）為美國Sigma公司產品；細胞衰老β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色試劑盒、細胞活力（CCK8）檢測試劑盒、堿性磷酸酶（ALP）染色試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；茜素紅染色試劑購自阿拉丁公司；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸和二甲基亞砜（DMSO）為美國Sigma公司產品。

1.2 SA-β-gal染色和CCK8實驗篩選D-Gal的誘導濃度

1.2.1 SA-β-gal染色 將BMSCs以6×104/孔的密度接種于6孔板中，并孵育24 h。用D-Gal（0、5、10、20、30 g/L）處理48 h后，吸出培養(yǎng)基，用PBS洗滌1次，用固定溶液固定細胞30 min。然后，用PBS洗滌3次，每次3 min，用新的染色工作液孵育過夜。顯微鏡下觀察細胞顏色及數量。SA-β-gal陽性細胞均為藍色。

1.2.2 CCK8實驗 將細胞以3×103/孔的密度接種于96孔板中，并孵育24 h。用D-Gal（0、5、10、20、30 g/L）分別處理BMSCs 24、48、72 h后，將CCK-8與培養(yǎng)基按1∶9的體積比混合，加入各孔，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min。使用酶標儀在450 nm波長下測定光密度（D）值，評估細胞活力，驗證不同濃度D-Gal對BMSCs細胞活性的影響，以確定D-Gal誘導BMSCs衰老的最佳濃度和作用時間。

1.3 GYY4137對D-Gal誘導的BMSCs衰老的影響

1.3.1 CCK8實驗確定GYY4137的干預濃度 用不同濃度（0、10、50、100、200 μmol/L）GYY4137分別處理正常BMSCs及30 g/L D-Gal誘導48 h的衰老BMSCs 24 h和48 h，CCK8實驗檢測細胞活力，方法同“1.2.2”。

1.3.2 SA-β-gal染色 將細胞以6×104/孔的密度接種于6孔板中，并孵育24 h。分為4組，CON組：正常BMSCs，GYY4137組：正常BMSCs+10 μmol/L GYY4137處理24 h，D-Gal組：正常BMSCs+30 g/L D-Gal處理48 h，D-Gal+GYY4137組：正常BMSCs+30 g/L D-Gal處理48 h+10 μmol/L GYY4137處理24 h。SA-β-gal染色同“1.2.1”。

1.3.3 qRT-PCR檢測衰老相關基因與炎癥相關基因 將BMSCs以5×104/孔的密度接種于6孔板中，按“1.3.2”分組及處理后，使用RNA提取試劑盒從BMSCs中分離總RNA。使用逆轉錄試劑盒合成cDNA。qRT-PCR采用CFX96TM實時PCR檢測系統(tǒng)，根據試劑盒說明書進行。目的基因的表達歸一化為GAPDH的表達。引物序列見表1。

1.4 GYY4137對衰老BMSCs成骨分化的影響

1.4.1 成骨分化潛能實驗 將BMSCs接種于細胞培養(yǎng)板中，應用含有10%胎牛血清和1%鏈霉素和青霉素的α-MEM孵育過夜，待細胞貼壁且生長至80%時，按“1.3.2”分組處理后，更換成骨培養(yǎng)基（1×10-7mol/L地塞米松、0.01 mol/L β-甘油磷酸鈉和5×10-5mol/L抗壞血酸），繼續(xù)培養(yǎng)，根據實驗要求，進行后續(xù)實驗。

1.4.2 ALP染色 將“1.4.1”中各組BMSCs接種于12孔板中，成骨誘導3 d后，用PBS洗滌細胞1次。用固定溶液固定細胞30 min后，用PBS洗滌3次，每次3 min，將細胞與堿性染料混合物在室溫、避光條件下孵育30 min后，顯微鏡下觀察細胞顏色及計算陽性細胞比例。

1.4.3 茜素紅染色 將“1.4.1”中各組BMSCs以1×104/孔的密度接種于24孔板中，成骨誘導21 d后，用PBS洗滌細胞1次，用固定溶液固定細胞30 min后，用PBS洗滌3次，每次3 min，將細胞與茜素紅染料混合物在室溫、避光條件下孵育30 min后，用顯微鏡觀察鈣結節(jié)顏色并計算陽性比例。

1.4.4 qRT-PCR檢測成骨相關基因 將“1.4.1”中各組細胞成骨誘導7 d后，應用qRT-PCR方法檢測成骨相關基因ALP、RUNX2、OCN、BMP2的mRNA表達，方法同“1.3.3”，引物序列見表2。

1.5 轉錄組測序及差異基因的驗證

對D-Gal組、D-Gal+GYY4137組細胞作相應處理后，用Trizol提取細胞總RNA，用磁珠富集純化RNA；將RNA片段合成雙鏈DNA；將雙鏈DNA末端鈍化，用“T”形連接體連接，所得產物進行PCR擴增。通過變性將PCR產物轉化為單鏈，在橋接引物引導下獲得單鏈環(huán)狀DNA文庫，用BGISEQ-500高通量測序儀檢測。根據RNA測序所得結果，qRT-PCR檢測4組細胞Wnt10b和β-catenin mRNA的相對表達，引物序列Wnt10b上游：5′-ATCCTGCACCTG-CGACTACAG-3′，下游：5′-GGCGACTTCTCGAAGTA-GACC-3′；β-catenin上游：5′-AAGTTCTTGGCTATTA-CGACA-3′，下游：5′-ACAGCACCTTCAGCACTCT-3′。

1.6 抑制Wnt/β-catenin通路對衰老BMSCs成骨能力的影響

D-Gal組：正常BMSCs+30 g/L D-Gal處理48 h；D-Gal+GYY4137組：正常BMSCs+30 g/L D-Gal處理48 h+10 μmol/L GYY4137處理24 h；D-Gal+Dickkopf相關蛋白1（DKK1）組：正常BMSCs+30 g/L D-Gal處理48 h+100 μg/LDKK1處理24 h；D-Gal+DKK1+GYY4137組：正常BMSCs+30 g/L D-Gal處理48 h+100 μg/L DKK1處理24 h+10 μmol/L GYY4137處理24 h。各組細胞經相應處理后，進行ALP染色及qRT-PCR檢測成骨相關基因。

1.7 統(tǒng)計學分析

所有實驗均至少獨立重復3次。應用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數據以均數±標準差表示，兩組均數的比較采用獨立樣本t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析，進一步組間比較采用SNK-q法。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 D-Gal誘導BMSCs衰老

SA-β-gal染色結果顯示，0 g/L D-Gal作用時，只有少數BMSCs為SA-β-gal陽性，隨著D-Gal濃度的增加，SA-β-gal陽性細胞的數量顯著增加（P＜0.01）。CCK8實驗結果顯示，細胞活力在24 h無顯著變化，48 h時30 g/L組較0 g/L組明顯降低（P＜0.01），72 h時各濃度細胞活力較0 g/L組均明顯降低（P＜0.01）。見圖1。綜合以上結果，后續(xù)實驗使用30 g/L的D-Gal培養(yǎng)48 h來構建BMSCs的衰老模型，此時SA-β-gal陽性細胞數量相對較多，細胞活力下降幅度相對較小。

2.2 GYY4137干預濃度的確定

如圖2所示，不同濃度的GYY4137對正常BMSCs在24 h及48 h內沒有明顯的毒性作用。對30 g/L D-Gal誘導的衰老BMSCs，隨著GYY4137濃度的增加，細胞活力在24 h內無明顯變化，而48 h后細胞活力較對照組明顯降低。因此，選擇10 μmol/L的GYY4137干預24 h進行后續(xù)實驗。

2.3 GYY4137可延緩BMSCs衰老

如圖3所示，與CON組相比，D-Gal組SA-β-gal染色陽性細胞比例、細胞衰老相關基因P16、P21、P53及炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA表達明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）；與D-Gal組相比，D-Gal+GYY4137組細胞衰老相關基因及炎癥因子的mRNA表達明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果表明GYY4137可保護BMSCs免受D-Gal誘導的細胞衰老。

2.4 GYY4137可增強衰老BMSCs的成骨分化能力

如圖4所示，與CON組相比，GYY4137組BMSCs的成骨基因ALP、RUNX2、OCN、BMP2 mRNA表達無明顯變化，D-Gal組BMSCs的ALP陽性細胞比例、鈣結節(jié)陽性比例、成骨相關基因表達均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；與D-Gal組相比，D-Gal+GYY4137組ALP陽性細胞比例、鈣結節(jié)陽性比例、成骨相關基因表達明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）。結果表明GYY4137可促進衰老BMSCs的成骨分化能力。

2.5 轉錄組測序及差異基因的驗證

RNA測序結果發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路中Wnt10b基因表達顯著改變（圖5A、B），通過qRT-PCR方法對測序結果進行驗證（圖5C），與D-Gal組相比，D-Gal+GYY4137組Wnt10b及其下游基因β-catenin的mRNA表達明顯增加（P＜0.01和P＜0.05）。

2.6 抑制Wnt/β-catenin通路后GYY4137對衰老BMSCs成骨能力的影響

如圖6所示，與D-Gal組相比，D-Gal+GYY4137組ALP陽性細胞比例及Wnt10b、β-catenin、ALP、RUNX2、BMP2、OCN的mRNA表達明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）;與D-Gal+GYY4137組相比，D-Gal+DKK1+GYY4137組各指標均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果表明GYY4137可能通過Wnt/β-catenin通路促進衰老BMSCs的成骨能力。

3 討論

衰老與許多疾病有潛在的關系，并一直是老年人的主要危險因素。衰老是一個漸進的過程，伴隨著各種生理功能的減速，導致死亡率的增加［6-7］。D-半乳糖是一種還原糖，當其濃度達到一定水平時，通過半乳糖氧化酶的催化轉化為醛糖和過氧化氫，產生活性氧，導致氧化應激、線粒體功能障礙和細胞凋亡［8］，最終加速衰老。衰老引起的老年性骨質疏松癥是一種系統(tǒng)性代謝性疾病，以骨密度降低、骨量減少、骨微結構退化為特征［9］，并伴有骨脆性、骨痛和骨折。目前，臨床上用于治療骨質疏松癥的藥物依然很少，研究有效、安全的藥物來加速骨形成、減少骨丟失成為解決骨質疏松癥的熱點。低劑量甲狀旁腺激素（PTH）可刺激成骨分化，促進骨形成［10］，間歇性應用可促進骨形成，但持續(xù)應用可誘導骨吸收。重組人PTH1-34-ForteoTM（特立帕肽）是美國食品和藥物管理局（FDA）唯一批準用于治療骨質疏松癥的骨形成藥物［11］。因此，尋找以促成骨為新治療靶點，開發(fā)安全有效的解決骨質疏松癥的臨床藥物具有非常重要的臨床意義。而促進BMSCs的成骨分化能力是治療骨質疏松癥的一大熱點［12-13］。

H2S是近年來發(fā)現(xiàn)的第3個內源性氣體信使分子，廣泛分布于人體的各個部位。在哺乳動物組織中，產生內源性H2S的酶主要有3種：胱硫醚β-合成酶（cystathionine β-synthase，CBS）、胱硫醚γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase，CGL or CSE）和3-巰基丙酮酸硫基轉移酶（3-mercaptopyruvatesulfur transferase，3MST）［14］。H2S曾被視為一種刺激性氣體，近來研究發(fā)現(xiàn)H2S是一種影響體內病理生理過程的氣體遞質。本研究結果顯示，與D-Gal組相比，D-Gal+GYY4137組衰老的細胞明顯減少，且細胞的成骨能力明顯增加，這表明外源性H2S可延緩BMSCs的衰老且能促進衰老BMSCs的成骨能力。

Wnt/β-catenin信號通路在促進BMSCs向成骨細胞分化過程中起著關鍵作用［5］，經典的Wnt/β-catenin通路成分的改變可以影響這一過程，DKK1是DKK家族的初始成員，是經典的Wnt/β-catenin通路拮抗劑。DKK1參與多種生理和病理過程，并在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［15］。有報道稱，DKK1通過下調基礎低密度脂蛋白受體相關蛋白（LRP5/6），改變G-蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）信號從而促進缺血誘導的DNA損傷［16］。DKK1的過表達導致了心臟循環(huán)和血液反流的缺乏，并由于內源性Wnt/β-catenin通路被抑制，阻斷了心內膜緩沖層的形成［17］。DKK1也作為致動脈粥樣硬化因子，增強原發(fā)主動脈內皮細胞內皮間充質轉化［18-20］。Wnt通路的激活導致了DKK1的表達，DKK1作為Wnt通路的靶基因和負反饋調節(jié)因子［21-22］，可使Wnt配體中的細胞脫敏，并能通過干擾LRP5/6共受體來抑制Wnt信號通路的表達。本研究結果表明GYY4137可激活Wnt/β-catenin信號通路，并促進衰老BMSCs成骨能力；通過DKK1抑制Wnt信號通路的表達，GYY4137對衰老BMSCs的促成骨能力顯著減低，驗證了GYY4137通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進衰老BMSCs成骨能力這一重要結論。

總之，本研究表明外源性H2S具有保護BMSCs免受老化的作用，并且可能通過Wnt/β-catenin信號通路促進衰老BMSCs的成骨能力。該實驗結果為進一步研究H2S的生物學功能及其臨床應用創(chuàng)造了條件。然而，還需要進行更多的研究來確定其在老年性骨質疏松癥中的潛在療效，以及在臨床應用中的安全性和有效性。

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［收稿日期］ 2023-12-08" ［編輯］ 何承志

［基金項目］昆山市骨質疏松性骨折防治重點實驗室（KZ2023005）；江蘇大學醫(yī)教協(xié)同創(chuàng)新基金重點項目（JDY2022013）

［作者簡介］范欽臣（1998—），男，碩士研究生；李翀（通訊作者），博士生導師，副教授，E-mail： lichong1705@163.com