乳品摻假檢測技術研究進展

趙成瑩，袁 靜，王寶菊，劉恒煜，劉承軍，周廣馳，李志強，劉 曉

1 聊城市東昌府區(qū)畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展中心，山東聊城 2520002 聊城市畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展中心，山東聊城 252000

0 引言

乳品含有蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等多種營養(yǎng)物質(zhì)，是人體獲得優(yōu)質(zhì)能量的重要來源。不同動物來源的乳具有一定差異，如駱駝乳、羊乳、馬乳、驢乳等特種乳價格相比普通牛乳更昂貴[1]。這些乳的價格昂貴除了產(chǎn)量低外，還有其他高營養(yǎng)價值的原因，例如駱駝乳因為不含β乳球蛋白，不飽和脂肪酸比例高，且富含較多營養(yǎng)物質(zhì)，所以具有較高市場價值，原料價格達50 元/kg，是牛奶的10倍，且純駱駝粉售價通常達1 200～1 900 元/kg[2]。為謀取更大利潤，有的商家為降低成本，將牛乳摻入其他類乳中售賣。研究者對市售特種乳樣本檢測發(fā)現(xiàn)，33 份乳樣中摻假率高達48.48%，嚴重擾亂市場[3]。國際藥典委員會的調(diào)查報告顯示，在25 種最容易摻假的食品成分中，乳成分摻假相關學術研究排第2，媒體相關報道排第7[4]。牛乳中含有超過30 種具有潛在致敏性的蛋白質(zhì)，也是世界衛(wèi)生組織認定的過敏性食物之一。摻假產(chǎn)品出現(xiàn)，容易引發(fā)一些對牛乳過敏的人群過敏，還涉及某些特殊醫(yī)療要求和宗教信仰[5]。這種摻假不僅影響市場穩(wěn)定，還損害養(yǎng)殖人員的經(jīng)濟利益，危害消費者身體，且不利于特種乳市場發(fā)展壯大。常規(guī)檢測手段很難對其檢測分辨，目前主要通過檢測其不同種屬來源的蛋白質(zhì)、脂肪酸和核酸進行區(qū)分，但都具有弊端。探究快速高效的新型檢測技術對促進乳業(yè)發(fā)展具有重要意義。本文通過分析特種乳摻牛乳的現(xiàn)狀，綜合概述各檢測手段原理和優(yōu)缺點，為特種乳摻假牛乳檢測技術的發(fā)展提供參考。

1 乳品摻假檢測技術

自2008年三鹿嬰幼兒奶粉事件開始，從最初往牛奶中摻水、淀粉、尿素、三聚氰胺、植脂末和水解動植物蛋白，發(fā)展到往特種乳中摻牛乳，乳品摻假問題出現(xiàn)不同變化。目前根據(jù)檢測機理不同，主要分為以下3 種類型。

1.1 基于蛋白質(zhì)的摻假檢測技術

蛋白質(zhì)作為乳品中最主要的營養(yǎng)物質(zhì)，其數(shù)量和種類較多，通常混雜在一起。常規(guī)的雙縮脲法和凱氏定氮法等，只能檢測其蛋白質(zhì)濃度，對具體的蛋白質(zhì)特性難以檢測，因此通常將蛋白質(zhì)分離后進行定性定量的檢測或利用蛋白質(zhì)抗原抗體的特性進行檢測[6]。

1.1.1 蛋白質(zhì)電泳技術

通過電泳將蛋白質(zhì)分離開，對不同類型乳中的差異性蛋白進行檢測，主要有二維凝膠電泳、毛細管電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳和微流體芯片電泳等技術。聚丙烯酰胺凝膠電泳是利用聚丙烯酰胺的特殊網(wǎng)狀結(jié)構，利用分子篩作用和電荷作用將蛋白質(zhì)進行分離的過程[7]。Pesic等[8]建立聚丙烯酰胺電泳對山羊乳和綿羊乳中摻入的牛乳進行定性和定量分析方法，通過對其α酪蛋白和β酪蛋白的條帶強度進行定量分析，有望用于乳摻假的快速檢測。阿力木·吾布力等[9]通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）電泳發(fā)現(xiàn)，與牛乳的乳清相比，山羊乳乳清缺乏乳鐵蛋白、駱駝乳缺乏β乳球蛋白、驢乳缺乏α乳白蛋白，可根據(jù)這一特性對不同特種乳中的摻假進行檢測，并發(fā)現(xiàn)牛乳摻入山羊乳、駱駝乳和驢乳的體積有效鑒別比例分別為1∶4，1∶10和1∶10。毛細管電泳是在外部高壓電場作用下，利用石英毛細管對物質(zhì)進行分離。田蘭等[10]利用毛細管電泳方法分離檢測乳品中的5 種乳源蛋白質(zhì)，并可測量乳粉和液態(tài)乳，具有較好的便捷性。Trimboli等[11]利用毛細管電泳方法檢測馬蘇里奶酪中摻入的牛乳成分，該方法具有較高線性標準，R2=0.968，相對標準差為1.18%。二維凝膠電泳是先利用等點聚焦技術，通過蛋白質(zhì)所帶電荷不同進行初步分離，然后再進行SDS-PAGE，利用蛋白質(zhì)電荷和分子量大小的不同進行全面分離。向明霞等[12]利用雙向電泳方法對酪蛋白和乳清蛋白的同源性進行檢測分析，為探索未知蛋白提供技術依據(jù)。微流體芯片電泳是將樣品放于電場下，使其在含有芯片的管道中泳動，并將泳動產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)為電信號后進行分析。尹艷[13]對比SDS-PAGE和微流體芯片電泳的優(yōu)缺點，發(fā)現(xiàn)微流體芯片電泳的檢測速度更快，準確性更高。

1.1.2 蛋白質(zhì)色譜檢測技術

液相色譜技術也是常用于分離、鑒定和定量乳中組分的分析技術之一，主要通過將樣品混合物送入色譜柱中，根據(jù)不同組分的穿過速度以及與色譜柱的相互作用而分離[14]。李玲玉等[15]以牛乳中的β乳球蛋白為標記物，利用液相色譜技術對駝乳中摻入的牛乳進行檢測，發(fā)現(xiàn)該方法具有較高的靈敏度，且在鮮乳、巴氏殺菌乳和乳粉中的檢出限分別為2%、3%和5%，并利用該方法對10 種市售駝乳粉進行檢測，發(fā)現(xiàn)其中4 種存在摻假。Ferreira等[16]同樣以β乳球蛋白為標記物，建立反相高效液相方法，測定并檢測牛乳和羊乳的混合乳，發(fā)現(xiàn)可在5%～95%的濃度范圍內(nèi)檢測不同乳種。Yang等[17]利用液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術對乳中摻入的植物性蛋白進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)摻入植物蛋白的乳和正常牛乳之間具有不同多肽的保留峰，通過主成分分析后能用于區(qū)分摻假乳。Guarino等[18]利用液相色譜-電噴霧質(zhì)譜技術分析山羊奶奶酪和牛奶奶酪多肽的區(qū)別，當山羊奶奶酪中牛乳占比超過50%或牛奶奶酪中羊乳超過2%時，均可檢測出來。杜文博[19]通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術對15 份羊奶粉中共有的正己醛、庚烯醛等揮發(fā)性特征風味物質(zhì)，并作為參照物用于檢測羊乳中摻入牛乳的指標，發(fā)現(xiàn)隨著牛乳摻入增多，揮發(fā)性特征風味物質(zhì)的檢測量越少。

1.1.3 近紅外光譜檢測技術

近紅外光譜可檢測出被掃描樣品混合物的組成和相關有機化合物的分子結(jié)構。Pereira等[20]利用近紅外光譜和偏最小二乘法對羊乳中的牛乳摻假進行鑒定和定量分析，發(fā)現(xiàn)該方法能鑒別羊乳中1%的牛乳組分。鄒婷婷等[21]通過近紅外光譜對摻了牛乳的羊乳進行檢測，建立分析模型，分析發(fā)現(xiàn)該模型能對羊乳粉中0.1～0.3 ng的牛乳粉進行檢測。劉永峰等[22]建立牛奶中尿素氮的近紅外檢測模型，通過目標函數(shù)法對其效果進行評定發(fā)現(xiàn)，其相關系數(shù)能達0.986 4，定標標準差為0.238，說明該方法具有較好適用性和準確性。

1.1.4 蛋白質(zhì)免疫學檢測技術

免疫球蛋白G（IgG）是1 種重要免疫因子，能在乳中穩(wěn)定存在，具有一定的物種特異性，適用于不同乳之間的摻假檢測。楊潔等[23]根據(jù)駝乳和牛乳中蛋白種類和組成差異，通過定性檢測駝乳源的α乳白蛋白、αs1酪蛋白、牛源性β乳球蛋白和κ酪蛋白，建立1 種檢測駝乳中摻入牛乳的間接酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，具有前處理簡單、過程快捷方便的特點。吉日木圖等[24]利用駝乳中的特異性重鏈抗體IgG3為目標蛋白，快速檢測駝乳中摻入其他特種乳的方法，具有檢測效果好、靈敏度高、檢測時間短的優(yōu)點。王士峰等[25]利用牛β-酪蛋白免疫小鼠，制備單克隆抗體3B9能特異性識別牛乳酪蛋白，并利用該方法檢測羊乳中摻入的牛乳，檢測范圍2.68～3.21 μg/mL， R2=0.996 6。薛海燕等[26]選擇κ酪蛋白為目標蛋白，以兔血清IgG和雞卵黃抗體IgY為檢測抗體，建立牛乳摻假ELISA定量方法。當κ酪蛋白為0.098～3.125 mg/L時，具有良好線性關系。Song等[27]以免疫磁珠為固相，β酪蛋白單克隆抗體吸附于免疫磁珠上作為捕捉探針，以辣根過氧化物酶作為檢測探針，檢測牛乳中的β酪蛋白。該方法的最低檢測限能達0.4 μg/mL，30 min內(nèi)可完成檢測。張世偉等[28]通過雙抗體夾心方法檢測羊乳和水牛乳中摻偽牛乳，靈敏度能達0.1 μg/mL，檢測時間1 h。

1.2 基于核酸的摻假檢測技術

乳中除含較多營養(yǎng)物質(zhì)外，還有一定數(shù)量的體細胞，因此可提取其中的DNA作為摻假檢測指標。由于乳中存在DNA含量較低，通常利用PCR擴增技術對目標DNA片段進行擴增快速檢測。Dalmasso等[29]以牛乳中的Cytb為靶基因，設計特異性較強的引物和探針，對摻入牛乳進行快速檢測，具有較高靈敏度，最低檢出限能達2%。楊艷歌等[30]針對8 種不同乳設計不同特異性引物，通過RT-PCR技術檢測發(fā)現(xiàn)該方法能區(qū)分不同種的乳樣，檢出限能達0.1%，絕對靈敏度達0.1～5 pg/μL。黎穎等[31]通過雙重PCR對羊乳中摻入的牛乳進行檢測，發(fā)現(xiàn)當牛乳摻入比例為1%，在酸奶中摻入比例為10%時，均能被準確檢測出來。Caterina等[32]通過熒光RT-PCR技術，建立能快速同時鑒定奶牛乳、羊乳、水牛乳等不同種屬乳源的檢測方法。總之，PCR在乳品真實性檢測中具有靈敏度高、準確性好的優(yōu)點，但經(jīng)過高溫殺菌或其他加工工藝處理后的乳中DNA會不同程度破壞，對該方法的實用性有一定影響。

1.3 基于脂肪酸的摻假檢測技術

氣相色譜技術可利用混合物不同組分的結(jié)構差異，在兩相之間的滯留時間不同進行分離鑒定。如羊乳中的長鏈脂肪酸C16：0和C18：0、不飽和脂肪酸C18：1和C18：3等脂肪酸的含量均低于牛乳，而短鏈脂肪酸C6：0、C8：0、C10：0和C12：0的含量則顯著高于牛乳，因此可根據(jù)該差異對乳品中的摻假進行檢測[33]。許昀暉等[34]通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術對6 種家畜乳中的脂肪進行檢測，建立相應脂肪指紋圖譜，根據(jù)脂肪類別判斷乳品種類，具有較好的實用價值。郭紫玥[35]通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術對牛乳、羊乳和人乳中脂肪酸差異進行對比分析，發(fā)現(xiàn)其ARA、DHA和EPA這3 種多不飽和脂肪酸存在變化和差異，可在后續(xù)乳品加工與開發(fā)中根據(jù)該特性進行加工優(yōu)化。

2 其他相關乳品檢測技術

除上述方法外，電子鼻、核磁共振等技術也廣泛用在乳品摻假檢測中。電子鼻可通過氣味檢測器對其中風味物質(zhì)的變化進行檢測，并將其轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枺舷鄳亩糠治龇椒ㄟM行綜合分析。吳丹丹等[36]利用電子鼻對氣味特征的區(qū)別記錄分析，建立1 種分辨駝乳中摻入牛乳的檢測方法，最低檢測線能達1%。金嫘等[37]用電子鼻對混入羊乳中的牛乳進行檢測，并進行主成分分析和線性判別分析，發(fā)現(xiàn)電子鼻能有效對摻入其中的牛乳識別鑒定。高曉霞等[38]利用電子鼻技術對奶粉中摻入的豆粉、尿素以及植脂末等物質(zhì)分析檢測，發(fā)現(xiàn)電子鼻均能有效檢測出其中的摻假成分。核磁共振技術主要根據(jù)食品中蛋白質(zhì)、水分、脂肪等物質(zhì)中的氫核吸收電磁能，發(fā)生能級遷躍產(chǎn)生弛豫現(xiàn)象。苗志英等[39]采用1H質(zhì)子核磁共振對牛乳中摻入的尿素、水和蔗糖等物質(zhì)進行檢測，摻假物質(zhì)會與牛乳中的蛋白質(zhì)爭奪水分子，使1H增多導致T2張馳時間延長，發(fā)現(xiàn)隨摻假濃度增高而更明顯，從而判定摻假乳的成分和特性。斯仁達來[40]通過低場核磁共振技術對駝乳中摻入的牛乳進行檢測，發(fā)現(xiàn)檢測限均在10%。

3 總結(jié)

乳品摻假是食品安全中長期存在問題。保證乳品質(zhì)量安全，發(fā)展相應的質(zhì)量檢測技術方法十分重要。雖然液相色譜、近紅外光譜等技術能滿足目前摻假測試需求，但成本高、操作復雜等，未能普遍應用。常規(guī)的電泳和PCR方法雖然準確度較高，但無法滿足大批量快速檢測需求。開發(fā)靈敏度高、可操作性強、成本低的檢測方法十分重要。在上述多種檢測方法中，以酶聯(lián)免疫吸附試驗為基礎的檢測試劑盒具有較好發(fā)展?jié)摿Γ憬荨⒖焖伲僮餍詮姟Ｖ挥袑Ω鞣N摻假檢測技術深入了解，加強其實用性和發(fā)展前景評測，才能保證乳品安全。