牛傳染性鼻氣管炎病毒的生物學特性、診斷方法和流行現狀

崔 平，王惠霞，李本科

濱州市農業技術推廣中心，山東濱州 256600

0 引言

奶牛受多種病毒侵害，其中傳染性較強的鼻氣管炎是一種危害性極強的病毒性傳染病。牛傳染性鼻氣管炎又稱“壞死性鼻炎”或“紅鼻病”，常由于牛傳染性鼻氣管炎病毒（牛皰疹病毒Ⅰ型）引起的一種急性、熱接觸性傳染病。該病毒入侵牛的呼吸道，主要表現為高熱、呼吸困難、鼻炎、鼻竇炎，有時引發結膜炎、腦炎、子宮炎、腸炎、膿包性外陰陰道炎及產奶量下降，導致母牛流產或死胎等，治療成本較大，給養殖場造成嚴重經濟損失[1]。該病最早于20世紀50年代在美國科羅拉多的育肥肉牛中被發現，以鼻氣管炎為主要癥狀，之后蔓延到加利福尼亞和洛杉磯等地，被命名為牛傳染性鼻氣管炎[2]。1956年Madin從病牛體內首次分離出了牛皰疹病毒Ⅰ型，證明牛傳染性鼻氣管炎由該病毒引起[3]。雖然奶牛感染牛傳染性鼻氣管炎病毒后病死率不高，但會導致機體免疫力下降，極易感染其它病原體[4]。該病臨床上具有潛伏感染期和隱性感染的特征，感染后自愈奶牛仍攜帶病毒，且無明顯病癥，為隱性感染，能向其他健康奶牛傳播病毒，導致奶牛患病，這也是該病持續感染、難以治療清除徹底的主要原因[5]。該病可通過多種方式傳播且速度極快，在大型集約養殖場，感染后陽性率可達70%以上，對肉牛生長和奶牛產奶量造成巨大影響。患病嚴重的地區會被列為疫區，禁止出口相關畜產品，造成養殖場經濟損失[6]。牛傳染性鼻氣管炎被世界動物衛生組織列為必須報告的B類動物疾病，我國將該病列為二類動物疫病，是牛類進出口的必檢項目[7]。因為該病毒只有一種血清型，目前預防該病最有效方式是注射相關疫苗[8]。為最大程度降低該病帶來危害，需研究牛皰疹病毒Ⅰ型的病原學、理化特性和基因組成結構等生物學特性，選擇合適快捷的診斷方法，了解流行現狀，做好預防，降低危害。

1 鼻氣管炎病毒的生物學特征

1.1 病毒的形態結構及理化特性

牛傳染性鼻氣管炎由皰疹病毒屬的牛皰疹病毒Ⅰ型引起，是皰疹病毒科的a皰疹病毒亞科水痘病屬[9]。牛傳染性鼻氣管炎病毒具有皰疹病毒類似外形，為正二十面體的對稱結構，外表類似球形，直徑150～220 nm，主要由外層囊膜、內部衣殼和核心三部分組成[10]。該病毒的衣殼外觀呈六角形，直徑80～120 nm，囊膜由宿主細胞來源的脂質和病毒編碼的蛋白或糖蛋白構成，核心是由雙股的DNA與蛋白質相互纏繞構成[11]。

牛皰疹病毒Ⅰ型對外界具有較強抵抗力，37 ℃能存活10 d， -4 ℃能存活30 d，-20 ℃能存活數月，-70 ℃能存活數年，但在56 ℃溫度下21 min即失去活性，因此實驗室中該病毒常在超低溫冰箱中（-80 ℃）保存[12]。該病毒對乙醚、丙酮、氯仿等有機溶劑較敏感，多種消毒劑（如0.5% NaOH溶液、1%酚類衍生消毒劑、1%季銨堿溶液、5%甲醇溶液和75%的酒精等）均可滅殺該病毒[13]。Straub[14]發現牛傳染性鼻氣管炎病毒在0.5% NaOH、0.01%HgCl2、1%漂白粉和1%酚類中數秒鐘即可被滅殺，在5%甲醛溶液中1 min即可滅活。該病毒在10 次以內的凍融時毒價不會降低，但經過胰蛋白酶消化后病毒感染力下降，且耐堿不耐酸，pH值6～9時可穩定存活，所以常保存在pH值7.0的細胞培養液中[15]。

1.2 病毒的基因學特征和相關蛋白組成

牛皰疹病毒Ⅰ型含有一個線性的雙股DNA基因組，長度約138 kbp，G+C占71%～72%，全序列主要包含長度106 kbp的長獨特區、長度為10 bp且帶有22 kbp重復序列的短獨特區。短獨特區兩端分別為反向的內部重復序列和末端重復序列（各11 kbp）。在DNA復制期間，長獨特區和短獨特區可翻轉，在DNA內串聯，生成病毒基因組的4 種異構體[16]。

牛皰疹病毒Ⅰ型基因組中，目前已鑒定73 個開放閱讀框，其編碼的蛋白質也已被定位[17]。該基因組能編碼33 種結構蛋白，其中12 個結構蛋白與囊膜形成有關，存在于病毒的粒子囊膜和病毒感染細胞的漿膜上。編碼的囊膜蛋白中，糖基化的蛋白10個，未糖基化的2 個。10 個糖基化蛋白基因位于基因組長獨特區有6 個（gL（UL1）、gM（UL10）、gH（UL22）、gB（UL27）、gC（UL44）、gK（UL53）），位于短獨特區有4個（gE（US8）、gI（US7）、gG（UL4）、gD（UL6））[18]，其中gB、gD、gH、gL和gK是病毒在細胞中生長的必需蛋白，而gB、gC、gD、gE為發揮毒性作用主要的糖基化蛋白，能刺激機體產生中和抗體。gB蛋白幫助病毒吸附和穿入宿主細胞，gC蛋白是病毒最重要的吸附蛋白，gD蛋白可刺激宿主機體產生持久的細胞免疫反應，gE蛋白主要作用于病毒在細胞間的傳播[19]。

對gB蛋白的研究較多，已完成克隆、測序等。GenBank 公布的完整gB基因有2 799 個核苷酸，位于長特異區，成熟gB蛋白的分子質量129 kDa，為2個74 kDa和55 kDa的多肽通過二硫鍵結合組成。該蛋白具有5 個能被機體免疫系統識別的位點，刺激機體發生免疫反應，還可與硫酸肝素結合代替gC蛋白的附著功能[20]。

gC蛋白同樣位于長特異區，分子質量為91 kDa，存在于病毒囊膜表面，具有多個抗原表位，具有較強吸附作用，能協助病毒穿透細胞。研究者將gC蛋白的表達基因敲除后，發現病毒在牛上呼吸道中的復制滴度顯著降低，說明該蛋白可能與病毒復制相關[21]。

gD蛋白由399 個氨基酸組成，分子質量為71 kDa，是牛皰疹病毒Ⅰ型復制的必需基因和主要結構蛋白。相比其他蛋白，gD蛋白能刺激機體產生更強免疫反應，能同時刺激體液免疫和細胞免疫。免疫實驗結果證明，單獨gD蛋白引起免疫反應比gB蛋白和gC蛋白更強烈，因此gD蛋白常為研究牛傳染性鼻氣管炎特異性抗原的首要選擇[22]。

gE蛋白是主要的毒力因子，由575 個氨基酸組成，分子質量為65 kDa，主要作用于病毒在細胞間傳播和誘導宿主機體免疫應答。該蛋白屬于跨膜蛋白，且胞外區是機體免疫系統識別的靶向抗原，常暴露在病毒顆粒表面。通常gE蛋白會和gI蛋白形成異二聚體，在宿主細胞內發揮運輸作用[23]。

除以上基因和蛋白外，TK基因也是牛傳染性鼻氣管炎病毒主要的毒力因子之一，在核酸代謝過程中起主要作用，是病毒復制過程中的非必需基因，也調節著病毒在神經細胞中的潛伏能力。缺失TK基因的病毒復制能力、毒力和潛伏能力大幅度下降，所以通常該基因被選為編輯基因缺失疫苗的首選靶基因[24]。同時，病毒中Vhs蛋白會加速細胞中mRNA降解，破壞細胞多聚核糖體結構；其中VP8蛋白能夠改善病毒的復制，當蛋白表達下降后會導致病毒的感染滴度下降，還會影響gB、gC和gD蛋白的表達量。這也是牛傳染性鼻氣管炎病毒具有較強傳播性、潛伏性和致病性的原因[25]。

2 鼻氣管炎病毒的診斷方法

對牛傳染性鼻氣管炎病毒感染的鑒定診斷有多種方式，常通過細胞分離鑒定、組織病理學、血清學、聚合酶鏈式反應（PCR）和實時熒光PCR、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和電子顯微鏡等。其檢測樣本采集通常根據臨床癥狀不同進行選擇，如呼吸道型采集鼻拭子、生殖道型公牛采集精液、母牛采集陰道分泌物、流產型采集胎兒胸水、肺等組織液。

2.1 病毒的分離鑒定

通過細胞進行病毒的分離鑒定是最簡單的方法，目前最常用的是牛胎腎傳代細胞和牛氣管傳代細胞，可將病毒接種到細胞上，觀察細胞病變程度，判斷病毒分離結果。該方法約需3 d。細胞從細長貼壁狀態轉變為橢圓形且聚集漂浮在細胞培養液中，說明出現病變，之后取細胞培養物與病毒陽性血清或單克隆抗體進行中和實驗。該方法被世界動物衛生組織定為國際貿易試驗方法之一[26]。雖然該檢測方法較可靠，但費時費力，不適用于大批量檢驗檢疫。

2.2 組織切片和電子顯微鏡觀察

該病毒能在牛的多個組織細胞生長繁殖（如腎、睪丸、皮膚和肺等），且能形成核內包涵體，所以可選取牛病變部位制備切片，進行熒光桃紅和酒石黃染色法觀察。通過顯微鏡可看到細胞核被染為藍色，包涵體為紅色，膠原為黃色[27]。在疾病早期感染階段，可通過電子顯微鏡觀察樣本中病毒顆粒的形態特征，從而快速診斷。

2.3 聚合酶鏈式反應（PCR）和實時熒光PCR

聚合酶鏈式反應是用于檢測病毒最常用、可信度最高的檢測方法，可在幾小時內獲得檢測結果，適用于大批量樣本快速檢測。1993年Wiedmann等[28]首次將PCR用于檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒，建立相應檢測方法，數小時內可獲得結果。PCR檢測技術被認為和病毒分離、斑點免疫雜交等手段具有相同準確性。但PCR常由于樣品污染或操作不當而出現假陽性結果，因此，實時熒光PCR技術成為新選擇。

實時熒光PCR相比普通PCR具有更高靈敏度、更強特異性和更好重復性，且隨著反應時間推移，檢測信號被逐步放大，能有效降低污染風險。劉占悝等[29]通過優化實時熒光PCR技術，發現其檢測下限最低可到3.04×101 copies/μL，有較好靈敏度。

2.4 血清學檢測方法

2.4.1 酶聯免疫吸附試驗

酶聯免疫吸附試驗可以用來診斷疾病是否受細菌或病毒感染，具有操作簡單、靈敏度高和速度快等優點，是國際貿易中較認可的檢測方法。特別是牛傳染性鼻氣管炎病毒中的gB、gC、gD、gE和gG蛋白都具有良好的免疫原性，常被作為ELISA檢測的靶蛋白，這也側面提高ELISA檢測的準確性。目前已有阻斷ELISA法和間接ELISA法試劑盒應用于該病毒檢測，且阻斷ELISA試劑盒的敏感性相比間接ELISA試劑盒更高[30]。

2.4.2 中和試驗

病毒中和試驗在血清學診斷檢測方法中是最標準和經典的牛傳染性鼻氣管炎病毒檢測技術[31]。由于該病毒的血清型只有1 種，可將樣品與病毒的陽性血清混合后判斷結果，缺點是靈敏度不高，容易出現假陽性。

2.4.3 膠體金技術

膠體金技術是以膠體金為顯色物質，檢測抗原或抗體的分子免疫標記技術，常用的是斑點免疫滲濾法和膠體金免疫層析法，具有便攜、靈敏度高、隨時檢測等優點。我國研究者利用膠體金技術建立了牛皰疹病毒Ⅰ型膠體金檢測方法，其普通PCR相比其陰性符合率高達99.17%[32]。

3 鼻氣管炎的傳播特性和流行現狀

自然條件下牛傳染性鼻氣管炎病毒的唯一宿主是牛，且各品種、年齡和性別的牛均有被感染的風險。秋冬季由于溫度、濕度和通風環境變化，會使該病的發病率上升。該病毒可通過空氣和接觸傳播，感染后病牛常有10～20 d潛伏期，之后出現明顯的臨床癥狀。感染后常體溫升高、食欲下降、精神不佳、呼吸不暢且鼻腔伴有潰爛，流出大量粘液，哺乳期母牛產奶量減少等，給奶牛養殖造成嚴重影響[33]。

該病最早發生在北美洲，Madin等學者分離出病毒毒株。隨著對該病毒不斷深入研究，大量病毒從健康牛，子宮炎、肺炎、呼吸道感染和乳腺皰疹性皮炎的牛中分離出來[34]。Saundeks等[35]對加拿大薩斯喀徹溫省1 077 頭牛開展血清抗體臨床調查，發現其中518 頭含有病毒的中和抗體，陽性率達48.1%。除了北美洲，歐洲也是較早存在該病毒的地區。馮學平[36]對瑞士弗里堡和澳大利亞的多起牛傳染性鼻氣管炎調查發現，由于進口白星公牛為隱性攜帶者，導致該病傳播。Wiseman等[37]對英國西部不同牛種群（肉牛、奶牛、犢牛）暴發的15 次傳染性鼻氣管炎進行調查，發現奶牛群中的發病率最高，達90%，且泌乳量明顯下降。大洋洲是奶牛養殖大洲，陳國強等[38]對大洋洲進口奶牛的病毒感染進行研究，發現澳大利亞和新西蘭廣泛存在牛皰疹病毒1型感染，且澳大利亞不同的牛群病毒陽性率為15%～96%，感染率極高。Patil等[39]對印度安達曼和尼科巴群島11 個村莊的418 份牛血清樣本進行檢測，發現107 份為陽性，陽性率25.60%。我國也有較多奶牛傳染性鼻氣管炎報道。皇甫和平等[40]對河南省5 個不同區域的12個規模化奶牛養殖場的440 份樣本調查研究發現，陽性患病奶牛68 頭，總體患病率15.45%，每個養牛場均有陽性樣本被檢測出，且陽性率最高的養牛場達68%。葉麗娜[41]對北京市不同地區的2 582 份牛血樣本分析發現，總陽性樣本數902 份，平均陽性率34.93%，其中房山區樣本的陽性率達100%。孫慶宇等[42]對內蒙古16 個奶牛養殖場進行調查，發現平均陽性率75.7%。希尼尼根等[43]對內蒙古的457 頭牛進行血清學流行病學調查，發現中東部地區較嚴重，某些養牛場的陽性率達100%，全自治區的平均陽性率29.5%。王永艷等[44]對山西省12 個區縣的665 頭奶牛檢測發現，陽性率49.6%。蘇姣秀等[45]對廣西27 個奶牛群的717 頭奶牛采樣檢測，發現陽性率26.74%。總之，牛傳染性鼻氣管炎病毒在全世界廣泛流傳，我國各地也廣泛流傳。預防該病毒傳播，降低影響，對奶牛養殖業發展至關重要。

4 小結

隨著研究深入，對牛傳染性鼻氣管炎病毒的認知逐漸清晰，特別對其結構、形態、功能和感染機制越來越了解。而對于該病毒的分離檢測和鑒定手段也在不斷更新，更簡單、快速、便捷和高效的檢測方法是未來疾病檢測手段的發展趨勢。因此，加強對該病及病毒認知，做好病毒的檢測工作，做好牛傳染性鼻氣管炎防控，有利于降低該病對奶牛機體健康及生產性能的影響，保證奶牛養殖業健康持續發展。