響應面法優選穿心蓮多糖大孔樹脂脫色工藝及其抗氧化活性研究

楊紫焰 李自霖 張翠香 黃麗金 陳貴元 李雪英

摘要 為了明確大孔樹脂脫除穿心蓮多糖中色素的工藝參數，研究大孔樹脂添加量、脫色時間以及脫色溫度對穿心蓮多糖脫色效果的影響，采用響應面法優選大孔樹脂脫除穿心蓮多糖色素的工藝，并探究穿心蓮多糖的體外抗氧化活性。結果表明，穿心蓮多糖大孔樹脂最佳脫色工藝為大孔樹脂添加量3.0 g/100 mL多糖溶液，脫色溫度50 ℃，脫色2.0 h，脫色1次。基于該工藝條件，穿心蓮多糖色素去除率可達81.35%，多糖保留率73.16%，穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的加權綜合評分77.25，表明該穿心蓮多糖大孔樹脂脫色工藝穩定，可用于穿心蓮多糖中色素脫除的生產實際。抗氧化試驗結果表明，穿心蓮多糖對·OH自由基有較好的清除作用，其具有一定的抗氧化活性。

關鍵詞 穿心蓮多糖；大孔樹脂；響應面法；脫色工藝；抗氧化活性

中圖分類號 TS201.1；S567.219? ?文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2024）10-0089-07

Optimization of macroporous resin for removing polysaccharide pigment from Andrographis paniculata by response surface method and its antioxidant activity

YANG Ziyan1? ? LI Ziling1? ? ZHANG Cuixiang1? ? HUANG Lijin1? ? CHEN Guiyuan1? ? LI Xueying1， 2

（1College of Basic Medicine， Dali University， Dali 671000， China;

2College of Agriculture and Biological Sciences， Dali University， Dali 671003， China）

Abstract In order to clarify the process parameters of using macroporous resin to remove pigments from Andrographis paniculata polysaccharides， the effects of resin dosage， decolorization time， and decolorization temperature on the decolorization effect of Andrographis paniculata polysaccharides were studied. The response surface methodology was used to optimize the process of using macroporous resin to remove pigments from Andrographis paniculata polysaccharides， and the antioxidant activity of Andrographis paniculata polysaccharides was investigated. The results showed that the optimal decolorization process for the polysaccharide macroporous resin of Andrographis paniculata was as follows： the amount of macroporous resin added was 3.0 g/100 mL of polysaccharide solution， decolorization temperature was 50 ℃， decolorization time was 2.0 hours， and decolorization was once. Based on this process condition， the removal rate of pigment from Andrographis paniculata polysaccharide could reach 81.35%， the retention rate of polysaccharides was 73.16%， and the weighted score of Andrographis paniculata polysaccharides pigment removal rate and polysaccharide retention rate was 77.25， which indicated that the macroporous resin decolorization process of Andrographis paniculata polysaccharides was stable and feasible which could be used for the actual production of pigment removal from Andrographis paniculata polysaccharides. The results of antioxidant experiments indicated that the polysaccharides of Andrographis paniculata had a good scavenging effect on ·OH free radicals， indicating that the polysaccharides of Andrographis paniculata had certain antioxidant activity.

Keywords? Andrographis paniculata polysaccharide; macroporous resin; response surface method; decolorization process; antioxidant activity

穿心蓮（Andrographis paniculata）又名苦膽草，為爵床科一年生植物，全草皆可入藥，主要分布在濕熱地區。穿心蓮性寒味苦，具有一定的清熱、消腫和解毒等功效[1]。穿心蓮根莖葉中均含有內酯、皂苷、黃酮、多酚和多糖等生物活性分子[2]。關于穿心蓮多糖的提取方面的研究已有相關報道[3-4]。多糖大多為水溶性大分子，常以水作為媒介進行提取，因此在提取多糖的時候，往往也會把水溶性色素物質提取出來。色素物質與多糖混在一起可能會對多糖的分離純化、結構鑒定及其活性等產生影響[5]。因此，去除多糖中的色素物質是多糖分離純化、結構研究和活性分析的重要環節，多糖脫色工作的開展對多糖結構和功能的研究意義重大。常用的多糖脫色方法有雙氧水氧化脫色法、活性碳吸附脫色法和大孔樹脂吸附脫色法，不同的脫色方法可能會對多糖的脫色效果、活性和結構產生影響[6-8]。雙氧水的氧化性強，脫色條件較為嚴苛，可能會影響多糖的活性[9]。活性碳吸附脫色法操作簡單，但是吸附特異性較差，吸附色素的同時也會吸附多糖，造成多糖的損失，且對大分子色素物質的吸附效果不佳[10]。大孔樹脂脫色法具有操作簡單、脫色條件溫和、重復性好且對多糖的結構及活性影響較小等優點[11-12]，是當前多糖脫色較為常用的方法。采用雙氧水氧化法和活性碳吸附法脫除苦膽草多糖中的色素的研究已有報道[13-14]，采用大孔樹脂作為脫色劑脫除穿心蓮（苦膽草）多糖中色素物質的研究尚未見報道。因此，本研究以FL-1型大孔樹脂作為脫色劑，考察脫色時間、大孔樹脂添加量和脫色溫度3個單因素對穿心蓮多糖中的色素物質脫除效果的影響，采用響應面法優選穿心蓮多糖大孔樹脂脫色工藝，探究脫色后的穿心蓮多糖的體外抗氧化活性，為穿心蓮多糖的開發研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

穿心蓮莖部干料購自云南大理某藥房，為爵床科穿心蓮屬植物穿心蓮的干燥地上部分，粉碎成60目粉末；葡萄糖標準品購自中國食品藥品檢定研究院（批號：110833－201506）；FL-1型大孔樹脂購于上海一基實業有限公司；抗壞血酸（Vc）購于Sigma公司；水楊酸購于上海試劑一廠；其他試劑均為國產分析純（AR），購于國藥試劑公司。

1.2 試驗儀器

試驗所用儀器有XPR204S/AC電子天平[梅特勒托利多科技（中國）有限公司]；水浴恒溫振蕩器（上海鄆曹電子科技有限公司）；XD-52水浴旋轉蒸發儀（上海賢德實驗儀器有限公司）；TS-100C型振蕩搖床（上海天呈實驗儀器制造有限公司）；UV-5100型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；KH22R型冷凍離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）；LGJ-10型真空冷凍干燥機（深圳市三莉科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 穿心蓮多糖的提取? 穿心蓮多糖的提取方法參照文獻[3]，多糖提取液經真空濃縮，采用Sevage法脫蛋白至280 nm 波長處無明顯吸收峰，蒸餾水稀釋無水乙醇使其最終濃度為85%，沉淀多糖12.0 h，回收乙醇，分別用丙酮、乙醚洗滌穿心蓮多糖沉淀物1次，真空冷凍干燥，得穿心蓮多糖粗品。

1.3.2 葡萄糖標準曲線的繪制? 將葡萄糖標準品于105 ℃烘干至恒重，稱取100.0 mg，溶解于去離子水中，并定容至1 000 mL。參考文獻[15]的方法制作葡萄糖標線，得線性回歸方程：Y=0.012 1X+0.076 9，線性擬和系數R2=0.998 9，提示在葡萄糖質量濃度（X）為0～0.06 mg/mL時，與吸光度（Y）的線性關系較好，可用于多糖質量濃度的測定。

1.3.3 穿心蓮多糖色素去除率的測定? 稱取0.5 g穿心蓮多糖干粉溶解于100 mL去離子水中。待充分溶解后，4 000 r/min冷凍離心5 min，收集上清液，取2 mL多糖上清液全波長掃描，在540 nm波長處穿心蓮多糖有最大吸收峰，所以選擇540 nm波長檢測穿心蓮多糖溶液的吸光度，多糖的色素去除率計算公式如下。

式（1）中，R為穿心蓮多糖色素去除率，%；A1為色素去除前穿心蓮多糖溶液的吸光度；A2為色素去除后穿心蓮多糖溶液的吸光度。

1.3.4 穿心蓮多糖保留率的測定? 參照文獻[16]的方法測定穿心蓮多糖的質量濃度。按式（2）計算穿心蓮多糖的保留率。

式（2）中，K為穿心蓮多糖的保留率，%；C1為穿心蓮多糖色素去除后的多糖質量濃度，mg/mL；C0為穿心蓮多糖色素去除前的多糖質量濃度，mg/mL。

1.3.5 穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的綜合評分? 參照文獻[17]的方法，選取色素去除率和多糖保留率的加權評分評價大孔樹脂對穿心蓮多糖的脫色效果，設定穿心蓮多糖的保留率（K）和穿心蓮多糖色素去除率（R）兩個指標的加權值各占50%，色素去除率和多糖保留率兩者加權的綜合評分（M）計算公式如下。

式（3）中，M為穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的綜合評分，分；R為穿心蓮多糖色素去除率，%；Rmax為穿心蓮多糖色素去除率的最大值，%；K為穿心蓮多糖的保留率，%；Kmax為穿心蓮多糖保留率的最大值，%。

1.3.6 大孔樹脂的活化處理? 參照文獻[18]的方法活化FL-1型大孔樹脂，用5%的鹽酸和5%的NaOH溶液分別浸泡樹脂6.0 h，去離子水洗滌樹脂至pH值呈中性，然后用95%乙醇浸泡樹脂6.0 h，回收乙醇，去離子水洗滌樹脂3次，4 000 r/min冷凍離心5 min，收集樹脂備用。

1.3.7 單因素試驗設計? 稱取0.5 g穿心蓮多糖粉末多份，去離子水分別定容至100 mL，得到多糖質量濃度為5 mg/mL的多糖供試液多份。分別考察脫色時間（A）、脫色溫度（B）和大孔樹脂添加量（C）對穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的影響。

1.4 響應面試驗設計

基于單因素試驗結果，以穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率兩者加權的綜合評分（M）作為檢測指標，按照表1設置各個因素及其水平，采用響應面法優選大孔樹脂脫除穿心蓮多糖中色素物質的工藝參數。

1.5 穿心蓮多糖清除·OH自由基的作用

參照文獻[19]的方法，取3支潔凈試管，分別標注測定管、空白管和本底管，分別向3支試管中加入1 mmol/L的FeSO4溶液2.5 mL。向空白管和測定管中各加入3 mmol/L的雙氧水2.5 mL，本底管中加入2.5 mL去離子水代替雙氧水；向測定管和本底管中各加入0.5 mL不同質量濃度的穿心蓮多糖溶液，向空白管中加入0.5 mL去離子水。最后向3支管中各加入3 mmol/L的水楊酸溶液4.5 mL，混勻，37 ℃孵育15 min。以3 mmol/L的水楊酸溶液作參比調零，測定510 nm波長處的各管吸光度。選用抗壞血酸（Vc）作為陽性對照，同法操作，將測得的各管吸光度代入式（4），計算穿心蓮多糖或者Vc對·OH自由基的清除率。

式（4）中，E為穿心蓮多糖或者Vc對·OH自由基的清除率，%；A0為空白管的吸光度；A1為穿心蓮多糖或Vc測定管的吸光度；A2為穿心蓮多糖或Vc本底管的吸光度。

1.6 試驗數據統計分析

各個試驗均3次重復，各個試驗的數據均采用平均值，應用Design-Expert 10.0開展響應面試驗，使用SPSS 9.0軟件對各個試驗的數據進行統計與分析。

2 結果與分析

2.1 脫色時間對穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的影響

如圖1所示，穿心蓮多糖的色素去除率隨著脫色時間的延長而不斷增加，穿心蓮多糖的保留率則不斷下降，可能是大孔樹脂對穿心蓮多糖也具有吸附作用，導致多糖保留率下降。當脫色時間達到2.0 h時，多糖色素去除率達到71.21%，多糖保留率為78.03%。當脫色時間超過2.0 h后，穿心蓮多糖的保留率則迅速下降。考慮時間成本以及減少多糖的損失，選擇2.0 h進行后續單因素試驗。選擇脫色時間1.0、2.0和3.0 h這3個水平開展響應面試驗。

2.2 脫色溫度對穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的影響

如圖2所示，穿心蓮多糖色素去除率與脫色溫度的增加呈正相關，但是穿心蓮多糖的保留率則隨著脫色溫度的增加呈現下降的趨勢。當脫色溫度達到50 ℃時，穿心蓮多糖色素去除率達到82.00%，多糖保留率為63.00%；當脫色溫度超過50 ℃后，穿心蓮多糖色素去除率增加緩慢，而穿心蓮多糖的保留率下降較快，可能是溫度過高引起多糖的水解，導致多糖的損失。為了減少穿心蓮多糖的損失，選擇脫色溫度50 ℃開展后續試驗。綜合考慮，選取脫色溫度40、50和60 ℃這3個水平開展響應面試驗。

2.3 大孔樹脂添加量對穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的影響

如圖3所示，隨著大孔樹脂添加量的增加，穿心蓮多糖色素去除率也有所增加，表明穿心蓮多糖色素去除率與大孔樹脂的添加量呈正相關，但是穿心蓮多糖保留率與大孔樹脂的添加量則呈負相關，可能是大孔樹脂吸附色素物質的同時也非特異性地吸附了穿心蓮多糖，導致多糖損失。當大孔樹脂添加量達到3.0 g時，穿心蓮多糖色素去除率達到75.00%，多糖保留率為76.00%，再增加大孔樹脂添加量，穿心蓮多糖色素去除率增加趨緩，多糖保留率則呈下降趨勢，為減少穿心蓮多糖損失，選擇大孔樹脂添加量3.0 g開展試驗，選擇大孔樹脂添加量2.0、3.0和4.0 g這3個水平開展響應面試驗。

2.4 響應面試驗分析相關指標對穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的影響

2.4.1 響應面試驗? 按照Design-Expert 10.0軟件的設計方案開展響應面試驗，得到的試驗結果如表2—3所示。表2中的試驗數據經Design-Expert 10.0軟件擬合分析，得到穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的綜合評分（M）與脫色時間（A）、脫色溫度（B）以及大孔樹脂添加量（C）之間的二次回歸方程：M=77.76-2.33A-1.96B-0.28C+0.22AB-1.01AC-2.83BC-6.51A2-11.72B2-9.62C2。

由表3的分析結果可知，該回歸模型P值<0.000 1，失擬項的P值為0.157 4，提示脫色時間（A）、脫色溫度（B）、大孔樹脂添加量（C）與穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的綜合評分（M）的擬合具有統計學意義。擬合系數（R2）為0.991 4，校正擬合系數（R2Adj）為0.980 4，提示脫色時間（A）、脫色溫度（B）和大孔樹脂添加量（C）3個因素與穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的綜合評分（M）的線性關系較好。

表3中A、B、A2、B2和C2的P值均小于0.05，提示A、B、A2、B2和C2對穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的綜合評分（M）的影響都具有統計學意義。表3中BC的P值小于0.05，表明BC對穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的綜合評分（M）的影響具有統計學意義。A、B和C的F值分別為25.37、18.06和0.38，提示脫色時間（A）、脫色溫度（B）和大孔樹脂添加量（C）對穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的綜合評分（M）影響的強弱順序為脫色時間（A）>脫色溫度（B）>大孔樹脂添加量（C）。

2.4.2 各因素交互作用分析? 響應曲面的陡峭程度和等高線的形態均可表示兩個因素間的交互作用是否具有統計學意義。響應曲面越陡峭，等高線形狀越接近橢圓，表示兩個因素的交互作用越具有統計學意義；響應曲面越平緩，等高線形狀越趨近圓形，則提示兩個因素的交互作用不具有統計學意義[20]。

由圖4可知，脫色時間（A）與脫色溫度（B）、脫色時間（A）與大孔樹脂添加量（C）之間的響應曲面較為平緩，且等高線趨近圓形，提示脫色時間（A）與脫色溫度（B）、脫色時間（A）與大孔樹脂添加量（C）間的交互作用不存在統計學意義（圖4A—B），表明AB、AC對穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的綜合評分（M）的影響不存在統計學意義。脫色溫度（B）與大孔樹脂添加量（C）間的響應曲面較為陡峭，等高線形狀接近橢圓形，提示脫色溫度（B）與大孔樹脂添加量（C）之間的交互作用存在統計學意義（圖4C），表明BC對穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的綜合評分（M）具有明顯影響。以上結果與表3中的方差分析結果基本一致。

2.4.3 工藝驗證試驗結果分析? 將表2的試驗數據導入Design-Expert 10.0軟件，通過軟件預測得到穿心蓮多糖的理論最佳脫色工藝參數：100 mL穿心蓮多糖溶液中添加大孔樹脂3.05 g，脫色1.82 h、脫色溫度49.13 ℃和脫色1次，得到多糖色素去除率和多糖保留率綜合評分的預測值為78.05。考慮到生產實際情況，將穿心蓮多糖的最佳脫色工藝參數調整為大孔樹脂添加量3.0 g/100 mL多糖溶液，脫色溫度50 ℃，脫色2.0 h，脫色1次。基于該工藝進行3次平行試驗并計算平均值，可得穿心蓮多糖色素去除率為81.35%，多糖保留率為73.16%，綜合評分為77.25，與理論預測值78.05較為接近，表明該穿心蓮多糖大孔樹脂脫色工藝穩定可靠，可用于穿心蓮多糖中色素脫除的生產實際。

2.5 穿心蓮多糖對·OH自由基的清除作用

如圖5所示，穿心蓮多糖對·OH自由基的清除率與多糖濃度呈相關性。當穿心蓮多糖質量濃度為0.6 mg/mL時，對·OH自由基的清除率可達44.64%，低于相同濃度的Vc對·OH自由基的清除率（98.42%），但穿心蓮多糖仍表現出一定的抗氧化活性。自由基的強氧化性對DNA、油脂和有機物具有一定的破壞性。臨床上常用Vc作為抗氧化劑清除自由基，但是其過量使用可能會引起副作用。穿心蓮多糖屬于天然產物，具有副作用小的優點，在食品、醫學領域具有作為天然抗氧化劑的潛在應用價值。

3 結論與討論

本研究以穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率作為考察指標，研究脫色溫度、脫色時間以及大孔樹脂添加量對穿心蓮多糖中色素去除的影響。基于單因素試驗結果，采用響應面法優選大孔樹脂脫除穿心蓮多糖色素的工藝參數。結果表明，穿心蓮多糖大孔樹脂最佳脫色工藝參數為大孔樹脂添加量3.0 g/100 mL多糖溶液，脫色溫度50 ℃，脫色2.0 h，脫色1次。基于該工藝參數開展脫色試驗，穿心蓮多糖色素去除率可達81.35%，多糖保留率為73.16%，穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的綜合評分為77.25，與理論預測綜合評分（78.05）的誤差較小，提示該穿心蓮多糖大孔樹脂脫色工藝穩定可行，可用于穿心蓮多糖色素脫除的實際生產。穿心蓮多糖體外抗氧化試驗結果表明，穿心蓮多糖對·OH自由基具有一定的清除作用，質量濃度0.6 mg/mL的穿心蓮多糖對·OH自由基的清除率可達44.64%，提示穿心蓮多糖仍具有一定的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑在食品、醫療等領域開發應用。

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（責編：王 菁）