響應面法優化樺樹汁醋醋酸發酵工藝

曲薇　王玉紅　姜秀煜　魏婷婷　賈鵬博

摘要：? 以樺樹汁為原料，篩選出適合樺樹汁醋醋酸發酵的菌種；在此基礎上，通過單因素和響應面試驗優化樺樹汁醋發酵工藝。結果表明：最適用于樺樹汁醋酸發酵的商業菌種為滬釀1.01號醋酸菌；最佳發酵工藝為：初始酒精度7%、醋酸菌接種量11%、發酵溫度28 ℃，此條件下釀造的樺樹汁醋呈微黃色，透明澄清，入口清爽，具有果醋的酸味和樺樹汁的清香，風格獨特，以期為樺樹汁醋工業化開發以及樺樹汁的綜合利用提供一定的理論基礎。

關鍵詞：? 樺樹汁；? 樺樹液醋；? 菌種篩選；? 發酵工藝；? 響應面法

中圖分類號：? ?TS 202. 1? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：? ?A? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：１００1 － 9499（２０24）03 － 0041 － 06

Optimization of Acetic Acid Fermentation Process of Birch

Juice by Response Surface Methodology

QU Wei WANG Yuhong JIANG Xiuyu WEI Tingting JIA Pengbo**

（Jiamusi Branch of Heilongjiang Academy of Forestry Sciences，? Heilongjiang Jiamusi 154000）

Abstract Using birch juice as raw material， the strains suitable for acetic acid fermentation of birch juice were screened. On this basis， the fermentation process of birch juice vinegar was optimized by single factor and response surface tests. The results showed that the most suitable commercial strain for acetic acid fermentation of birch juice was acetic acid bacterium HuNiang 1.01. The optimum fermentation process was as follows： the initial alcohol content was 7%， the inoculation amount of acetic acid bacteria was 11%， and the fermentation temperature was 28 ℃. Under these conditions， the brewing birch juice vinegar was slightly yellow， transparent and clear， and the mouth was fresh. It had the sour taste of fruit vinegar and the fragrance of birch juice， and the style was unique， in order to provide a certain theoretical basis for the industrial development of birch juice vinegar and the comprehensive utilization of birch juice.

Key words Birch juice; birch vinegar; strain screening; fermentation process; response surface methodology

樺樹（Betula platyphylla）是樺木科落葉喬木，具有較強的適應性和抗寒性[ 1 ]，主要分布在我國的東北、西北以及西南山地區域[ 2 ]。將樺樹樹皮劃開或在樹身鉆孔，會流出無色或淡黃色透明液體，帶獨特木質清香[ 3 ， 4 ]。樺樹汁含有天然蛋白質和營養物質，但不同生長環境會對樺樹汁中的營養成分、理化性質產生影響[ 5 ]。樺樹汁中蘊含著人體所需的各種氨基酸[ 6 ]、礦物質、脂肪酸等常見營養成分，此外，還含有過氧化物酶、過氧化氫酶、樺芽酸、細胞分裂素、香精油和皂角甙化合物等活性成分[ 7 ]。

樺樹汁具有祛痰止咳、促進人體新陳代謝、抗疲勞、增強機體免疫力等作用[ 8 ]。常見的樺樹汁飲品主要以復合果汁飲料和果酒的形式[ 9 - 11 ]。目前，關于樺樹汁醋的發酵產品鮮有報道[ 12 ]，而對樺樹汁醋發酵工藝的系統研究更少。本研究以樺樹液為主要原料，通過液態發酵工藝制備樺樹汁醋。通過試驗篩選適用于樺樹汁醋醋酸發酵的商業菌種，并采用單因素和響應面試驗優化樺樹汁醋的發酵工藝，旨在為樺樹汁醋工業化開發以及樺樹汁的綜合利用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1. 1 材料與試劑

樺樹液：采自伊春市帶嶺區東方紅林場；白砂糖：天津市鼎盛鑫化工有限公司；殼聚糖（食品級）：廣州天佳生物科技有限公司；澳大利亞DVI0釀酒酵母：上海杰兔工貿有限公司；許氏醋酸菌：上海保藏生物科技中心；巴氏醋酸菌：中科院微生物研究所；滬釀1.01號醋酸菌：上海工業微生物研究所；檸檬酸（分析純）：長春健鷹食品添加劑公司；氫氧化鈉（分析純）哈爾濱新春化工產品有限公司；偏重亞硫酸鉀（分析純）：天津市大茂化學試劑廠。

1. 2 儀器與設備

ESJ182-4型電子天平：上海拓西電子科技有限公司；PHS-3C型精密pH計：杭州雷磁分析儀器廠；HJ-6磁力攪拌器：天津市濱海新區大港紅杉實驗設備廠；HWS-70B恒溫恒濕箱：青島明博環保科技有限公司；721紫外可見分光光度計：上海力辰儀器科技有限公司；YXQ-LS-50SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業有限公司。

1. 3 試驗方法

1. 3. 1 樺樹汁醋的加工工藝流程

樺樹汁醋的加工工藝流程如圖1所示。

（1）采集樺樹汁

在樺樹葉還未長出前，樺樹汁開始流動時對樺樹汁進行采集，并對采集的樺樹汁進行密封后冷凍貯存。

（2）調節糖度、酸度

使用白砂糖將樺樹汁的糖度調整為20%，使用檸檬酸將pH值調整為5.5。

（3）酒精發酵

在釀酒酵母中加入10倍質量的5%蔗糖溶液后，將其放置在32 ℃下活化20 min，得到酵母菌種子液。將酵母菌種子液接種到樺樹汁中（接種量為0.3%），攪拌均勻后，置于溫度為26 ℃，轉速為130 r/min的條件下進行酒精發酵7 d。隨后對樺樹汁酒進行85 ℃滅菌處理15 min，冷卻至室溫后，待用。

（4）醋酸發酵

參照何宇寧[ 13 ]的方法將醋酸菌進行活化與培養，再將醋酸菌接種于樺樹汁酒中，在溫度為31 ℃，轉速為130 r/min的條件下進行醋酸發酵，待醋酸含量不再增加時終止。

（5）澄清、過濾

參照王瑞璇的方法對樺樹汁醋進行澄清處理[ 14 ]。

（6）殺菌、灌裝

將澄清后的樺樹汁醋置于80 ℃水浴下滅菌20 min后，無菌裝瓶，即得樺樹汁醋成品。

1. 3. 2 醋酸菌的篩選

將培養好的許氏醋酸菌、滬釀1.01號醋酸菌和巴氏醋酸菌分別作為1號、2號和3號醋酸菌種子液，并以11%的添加量加入到樺樹汁中，在28 ℃下進行醋酸發酵，以樺樹汁醋的總酸含量作為醋酸發酵狀況的指標，選出發酵性能好，樺樹汁醋口感佳的醋酸菌。

1. 3. 3 醋酸發酵的單因素實驗

通過酒精發酵制得樺樹汁酒，再對樺樹汁酒進行醋酸發酵制得樺樹汁醋。在實驗過程中分別將初始酒精度、發酵溫度和醋酸菌的接種量作為自變量，用酸度作為評價指標，探究不同的初始酒精度（5%、6%、7%、8%、9%）、發酵溫度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）和醋酸菌接種量（5%、7%、9%、11%、13%）對樺樹汁醋的影響。

1. 3. 4 醋酸發酵的工藝優化

在單因素試驗的基礎上，以初始酒精度（A）、發酵溫度（B）和醋酸菌接種量（C）作為自變量，總酸作為響應值，進行響應面優化試驗，相應水平設計見表1。

1. 3. 5 總酸含量測定

樺樹汁發酵液酸度的測定參考國標GB/T5009.

239-2016《食品酸度的測定》酸堿滴定法。

1. 3. 6 感官評價

選擇食品專業10名感官品評人員對樺樹汁醋進行感官評價，并按照表2樺樹汁醋的感官評分細則給予相應的分數。

1. 3. 7 微生物微指標測定

菌落總數、大腸菌群及沙門氏菌的測定分別參照GB 4789.2-2022、GB 4789.3-2016和GB 4789.4-2016項下方法及標準進行測定。

2 結果與分析

2. 1 醋酸菌的篩選

2. 1. 1 不同醋酸菌菌種對樺樹汁發酵液產酸量的影響

從圖2可以看出，隨著發酵時間的增加，發酵液中酸度呈現先增高后平緩的現象。其中添加2號醋酸菌種子液的發酵液總酸含量最高達到5.30 g/? 100 mL，并且發酵用時為8 d，最短；添加3號醋酸菌種子液的發酵液總酸含量最低為3.91 g/100mL，發酵用時為10 d。

2. 1. 2 不同醋酸菌菌種對樺樹汁發酵醋感官品質的影響

由圖3可知，選用2號醋酸菌種子液發酵的樺樹汁醋整體可接受度最高，選用3號醋酸菌種子液發酵的樺樹汁醋整體可接受度最低。色澤方面，選用2號醋酸菌種子液和1號醋酸菌種子液發酵的樺樹汁醋評分相同，色澤差別較小，均呈現微黃色，光澤度較高，選用3號醋酸菌種子液發酵的樺樹汁醋光澤度較差；香氣方面，選用2號醋酸菌種子液發酵的樺樹汁醋香氣純正，具有果醋的酸味和樺樹汁的清香，評分最高，1號醋酸菌種子液發酵的樺樹汁醋香氣較淡，3號醋酸菌種子液發酵的樺樹汁醋香氣最次；口感方面，選用2號醋酸菌種子液發酵的樺樹汁醋入口清爽、口味協調，1號醋酸菌種子液發酵的樺樹汁醋入口較清爽、口味有待協調，3號醋酸菌種子液發酵的樺樹汁醋入口無清爽感、口味差；澄清度方面，選用2號醋酸菌種子液和1號醋酸菌種子液發酵的樺樹汁醋澄清透明，無肉眼可見的雜質，選用3號醋酸菌種子液發酵的樺樹汁醋有少許沉淀物。

2. 2 樺樹汁醋醋酸發酵單因素試驗結果

2. 2. 1 發酵溫度對樺樹汁醋酸度的影響

將初始酒精含量為7%的樺樹汁酒接種醋酸菌（接種量為11%）后分別在24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃下進行醋酸發酵。從圖4可以看出，發酵溫度32 ℃發酵液中總酸最少，這主要歸因于發酵溫度過高時，醋酸菌的生長代謝過旺，以及高溫對產物累積不利等因素所致[ 15 ]；發酵溫度28 ℃時樺樹汁醋發酵液中的總酸含量達到最大值；當溫度低于28 ℃時，會使總酸含量較低，其原因可能是溫度偏低導致醋酸菌的活躍性會有所下降。因此，樺樹汁醋的最適發酵溫度為28 ℃。

2. 2. 2 醋酸菌接種量對樺樹汁醋酸度的影響

將初始酒精含量為7%的樺樹汁酒分別接種5%、7%、9%、11%、13%的醋酸菌后，在28 ℃下進行醋酸發酵。從圖5可以看出，發酵液內總酸含量隨接種醋酸菌數量增多呈先升后降變化趨勢，這是因為醋酸菌的產酸速度隨著醋酸菌數量的增多而加快。醋酸菌接種量為11%時，發酵液內總酸含量達到最大值5.79 g/100 mL；醋酸菌接種量大于11%后發酵液總酸含量下降，這可能是因為醋酸菌接種量過大，菌體增長繁殖耗費了樺樹汁發酵液內大部分營養，使得醋酸發酵相關的底物含量降低，不利于醋酸發酵；也可能是菌體快速消耗營養物質產生大量的代謝物質，使得醋酸菌提前衰老、自溶，從而降低了發酵液的總酸含量[ 16 ]。因此，樺樹汁醋的最適醋酸菌接種量為11%。

2. 2. 3 初始酒精度對樺樹汁醋酸度的影響

將初始酒精含量為5%、6%、7%、8%、9%的樺樹汁酒分別接種醋酸菌（接種量為11%）后在28 ℃下進行醋酸發酵。從圖6可以看出，隨著初始酒精度數的升高，發酵液內總酸含量也逐漸升高。當初始酒精含量為7%時，樺樹汁發酵液內總酸含量最高達到5.81 g/100 ml；當初始酒精含量高于7%時，發酵液內總酸含量出現下降的趨勢，這可能是因為發酵初始階段，高濃度的酒精使醋酸菌的成長、代謝受到限制，從而導致發酵液內總酸含量降低[ 17 ]。因此，樺樹汁醋的最適初始酒精含量為7%。

2. 3 樺樹汁醋醋酸發酵響應面試驗結果

利用Design-Expert 13.0 軟件對表3中的數據進行多元回歸擬合，得到總酸與各因素的二次多項回歸方程模型為：

總酸（g/100 mL）=5.80-0.055A+0.03B-0.1025C+0.005AB-0.055AC-0.105BC-0.6283A2-0.2733B2-0.3583C2。

由表4和圖7可知，該模型F值為25.78，P值=0.001 1＜0.01，表明該模型因子具有顯著性意義。模型的方程相關系數R2=0.978 9，校正系數R2Adj= 0.940 9，表明該模型的擬合度和可信度較好，可以對樺樹汁醋醋酸發酵工藝進行預測和分析。各因素對總酸含量的影響依次為：發酵溫度（B）<初始酒精度（A）<醋酸菌接種量（C）。通過軟件Design-Expert 13.0分析，在初始酒精度為6.963%vol，發酵溫度為28.167 ℃，醋酸菌接種量為10.694%時，醋酸發酵工藝最佳，此時樺樹汁醋總酸含量理論值為5.807 g/100 mL。為了便于實際操作，對樺樹汁醋最佳工藝參數進行修正，即初始酒精度為7%vol，發酵溫度為28 ℃，醋酸菌接種量為11%。平行3次試驗，樺樹汁醋酸度實際值為（5.81±0.01）g/100 mL，與模型的理論預測值接近。因此，該模型可行。

2. 4 優化醋酸發酵工藝前、后樺樹汁醋的感官評價

由圖8可知，優化醋酸發酵工藝后樺樹汁醋的香氣、口感和整體可接受度大幅度提升。優化醋酸發酵工藝制得的樺樹汁醋醋樣為清亮透明的微黃色，無肉眼可見的雜質，香味協調，具有果醋的酸味和樺樹汁的清香，入口清爽，整體可接受度高。

2. 5 樺樹汁醋微生物指標檢測結果

樺樹汁醋的菌落總數為28 cfu/mL，未檢出大腸菌群、致病菌，符合國標中微生物限量標準。

3 結 論

本試驗篩選出適用于樺樹汁醋醋酸發酵的商業菌種為滬釀1.01號醋酸菌。根據單因素試驗和響應面試驗得到的最佳發酵工藝條件為：發酵溫度為28 ℃，醋酸菌接種量為11%，初始酒精度為7%。在此條件下制得的樺樹汁醋酸度為5.81 g/100 mL，醋樣呈現清亮透明的微黃色，無肉眼可見的雜質，香味協調，具有果醋的酸味和樺樹汁的清香，入口清爽，整體可接受度高，且其微生物指標符合國家標準。

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