阿爾茨海默病外周血早期生物標志物及其分析方法研究進展*

祁 艷 綜述,張臻昊,劉 玉,劉欣夢,陳娜娜,勞可靜 審校

(西安醫學院/基礎與轉化醫學研究所,陜西 西安 710000)

阿爾茨海默病(AD)是一種起病隱匿、病理復雜的神經退行性疾病,臨床特征包括不可逆腦損傷、認知障礙、日常生活自理能力下降,最終可發展為癡呆和死亡。據統計,AD已發展為最常見的癡呆和世界范圍內老年人殘疾增加的主要原因[1]。目前,AD臨床診斷主要依靠影像學技術結合認知測試[2-3],通常確診時已發展到中晚期。雖然AD尚無有效的治療方法,但早期診斷和干預仍有利于減少神經損傷,延緩病情進展,從而提高患者的生活質量。

AD患者的病理學特征主要為β淀粉樣蛋白(Aβ)在大腦中細胞外沉積形成老年斑,Tau蛋白的過度磷酸化造成腦神經細胞內的神經元纖維纏結[4-5]。在AD極早期,腦脊液(CSF)中某些蛋白標志物Aβ40、Aβ42、總Tau蛋白(T-tau)、過度磷酸化Tau蛋白(P-tau)等水平會發生改變[6]。然而,臨床上為了實現CSF中標志物的檢測,常需要通過腰椎穿刺獲取CSF。但該方式為有創操作,對患者傷害較大,且價格昂貴,患者可接受度有限,不利于AD的早期診斷。MONTAGNE等[7]研究發現,AD患者血腦屏障存在損傷,導致CSF中某些蛋白標志物能夠在疾病早期穿越血腦屏障,進入外周血循環,從而使得血液蛋白標志物水平在發病極早期就發生很明顯變化。因此,外周血中AD蛋白標志物的無創檢測技術因樣本采集方便、創傷小,成為最具潛力的早期篩查和隨診手段,為AD早期診斷帶來了新希望[8]。然而AD蛋白標志物在外周血中水平極低,傳統免疫分析方法無法實現其水平的精準定量分析。近年來發展的一些免疫分析新技術,其靈敏度大大提高,被廣泛應用于超微量蛋白標志物的分析[9-11]。本文對AD早期外周血生物標志物及其檢測技術的研究進展進行了綜述。

1 外周血中AD相關生物標志物

1.1Aβ Aβ由淀粉樣前體蛋白經過β-分泌酶和γ-分泌酶連續裂解形成,最常見的是包含40個氨基酸的Aβ40與42個氨基酸的Aβ42[12]。在健康人腦組織中,Aβ的生成與清除處于動態平衡狀態;在AD患者腦組織中,Aβ表達水平過量,清除作用減弱,導致其在細胞膜外逐漸沉積形成老年斑,對神經元產生毒性作用,使得神經元變性,最終導致AD的發生[4,12]。

最初的研究結果顯示,AD組和對照組血液Aβ42水平無顯著差異,提示血液Aβ42水平主要反映外周的情況,而非腦中的Aβ水平。在最近幾項研究中,研究者將免疫沉淀反應質譜分析[13-14]及Elecsys免疫分析[15]等高靈敏度分析技術用于血液中Aβ的檢測,由于這些檢測平臺具有更高的精度,并且可以在同一時間內測定同一樣品中Aβ42和Aβ40水平,使得血液Aβ42/Aβ40比值在臨床上展示出廣闊的應用前景。如使用免疫沉底質譜測定血液中Aβ水平,可以準確預測基于正電子發射體層攝影(PET)成像的輕度認知障礙(MCI)和AD患者腦淀粉樣蛋白狀態[14]。淀粉樣PET陰性但血液Aβ42/Aβ40比值異常的患者,在未來有很大風險會發展為PET陽性,說明血液Aβ42/Aβ40比值可用于預測和篩選淀粉樣PET陽性個體及AD的早期初步篩查[13]。此外,基于Elecsys免疫分析測定血液中Aβ水平的研究同樣表明,在AD發展的各階段,血液Aβ42/Aβ40水平在預測Aβ狀態時表現出較高的準確性[15]。以上研究結果均表明,血液Aβ在預測患者腦淀粉樣蛋白狀態及AD早期診斷方面具有廣闊的應用前景。

1.2Tau蛋白及P-tau Tau蛋白是一種微管相關蛋白,通過與微管蛋白相互作用來維系神經元骨架系統的穩定[5]。AD發病機制的另一主流假說是,Tau蛋白的過度磷酸化造成的腦神經細胞內神經元纖維纏結(NFTs)。研究表明,AD患者腦神經細胞內NFTs的大量形成會導致神經元退化,從而釋放Tau蛋白,使得CSF中Tau水平增加,其水平與MCI向AD的發展密切相關[16]。

相比CSF中Tau蛋白水平,穿越血腦屏障進入血液中的Tau水平非常低,由于檢測手段受限及大量隊列研究的缺乏,在早期研究中,有關血液Tau蛋白水平作為AD診斷標志物的報道較少見。近年來,由于檢測技術的快速發展,研究者將單分子陣列(Simoa)和基于電化學發光技術的MSD檢測系統用于AD患者血液中P-tau181、P-tau231和P-tau217的分析[17-21],使得血液P-tau蛋白水平作為AD早期診斷標志物的研究成為熱點方向。一項研究表明,患者在臨床上被診斷為AD前,血液P-tau181水平就開始升高,在MCI和癡呆期進一步升高,且血液P-tau181水平與CSF P-tau181水平及Tau PET呈正相關[17]。有研究表明,至少在患者死亡前8年,血液P-tau181就能準確預測AD的病理特征[19]。研究表明,AD患者血液P-tau181水平較對照組升高3.5倍左右,且可以有效地將AD與其他神經退行性疾病(如額顳癡呆病區)分開[18]。一項針對3個選定的隊列共1 402例患者的研究發現,與其他血液標志物和核磁共振成像相比,P-tau217水平可以更好地將AD和其他神經退行性疾病區分開,其準確性與PET成像結果無顯著差異[20]。在該項研究中,隊列3為PSENI突變攜帶者,研究發現在不溶性Tau聚集物未被Tau-PET檢測到即AD極早期時,血液P-tau217水平已經在AD患者中增加了大約7倍,甚至在認知障礙出現前20年,P-tau217水平就開始上升。最近的一項研究表明,血液P-tau231和P-tau217水平與AD患者腦中早期Aβ沉積最為相關,可以作為臨床前AD患者Aβ病理學狀態的生物標志物,其能夠在患者大腦出現明顯Aβ斑塊前,更好地捕捉大腦Aβ的變化[21]。以上研究結果表明,Tau蛋白尤其是特定位點P-tau蛋白是具有廣闊發展前景的AD早期診斷標志物。

1.3神經絲輕鏈蛋白(NFL) NFL是一種中間絲蛋白,主要表達于粗有髓軸突中,具有維持神經元結構穩定和調節軸突直徑的作用。當軸突損傷時,NFL將釋放到細胞空間外,導致CSF中NFL水平增加[22]。

在AD患者大腦中,神經元變性的發生會加速NFL向CSF和血液釋放[22]。研究發現,CSF中NFL水平和血液中NFL水平相關,MCI和具有Aβ病理特征的AD患者血液NFL水平均高于健康對照組,且CSF和血液中NFL水平升高與認知能力下降、腦萎縮及腦代謝減退有關[23]。最近一項同時針對認知未受損(CU)、MCI和AD患者的研究發現,MCI和AD患者CSF和血液NFL水平均升高[24]。但在具有Aβ病理特征的CU患者中,只有CSF中NFL水平增加,血液中NFL水平沒有變化,且在AD轉基因小鼠模型中,隨著Aβ病理特征的發展,CSF中NFL水平增加要先于血清。因此,對CU個體來說,與血液NFL相比,CSF中NFL可能更適合作為生物標志物進行早期診斷。此外,一項足夠數量的隊列研究結果表明,雖然AD患者血液和CSF中NFL水平增加,但其增加的特異性并不高,NFL水平在很多其他神經退行性疾病的血液和CSF中同樣會升高,尤其是額顳葉癡呆、肌萎縮性側索硬化癥和非典型帕金森病[25]。

總之,CSF和血液中NFL水平升高與AD的發展密切相關,NFL雖然不是AD特異性的生物標志物,但仍然可能在AD早期篩查、預測病情發展及藥物試驗預后監測中起到不可替代的作用。

1.4外泌體 外泌體是一種長徑在100 nm左右的細胞外囊泡,其中攜帶大量特異性蛋白、脂質、RNA、microRNAs、DNA等其他生物活性物質。在大腦中,外泌體可以來自包括神經元、小膠質細胞和星形膠質細胞在內的所有細胞,在細胞通信及細胞功能調節中發揮關鍵作用,外泌體可以通過CSF廣泛傳播至整個大腦,且可以通過血腦屏障釋放到外周血中[26]。

研究表明,外周血中神經元和星形膠質細胞來源的外泌體可以作為生物標志物反映AD患者的病理特征,并可用于AD早期診斷[27]。此外,神經源性外泌體中的多種特異性蛋白同樣可以作為生物標志物反映AD的發展過程。SARDAR SINHA等[28]發現,AD患者大腦分泌的外泌體中Aβ寡聚體水平明顯增加,且通過阻斷腦源性外泌體的形成、分泌或攝取,減少Aβ寡聚體的擴散并降低其毒性。有研究團隊發現,AD患者血液中神經源性外泌體內p-S396-tau、p-T181-tau及Aβ42水平均明顯升高,其水平不僅可以在患者出現癥狀10年前預測AD的發生,還可以準確預測患者從MCI發展為AD的過程[29-30]。最近,一項針對外周血中神經源外泌體Aβ42、T-tau、P-tau181的研究發現,外周血神經源性外泌體中Aβ42、T-tau和P-tau181水平均可以反映AD患者大腦的病理變化,AD患者Aβ42、T-tau和P-tau181水平均明顯高于MCI患者和對照組患者,且外泌體中3種蛋白水平與其在CSF中的水平高度相關,二者表現出相同的診斷能力[30-31]。該團隊的另一項研究發現,通過聯合檢測血液外泌體中突觸生長相關蛋白43、神經粒素、突觸小體相關蛋白25和synaptotagmin 1水平[32],可以在患者產生認知障礙5～7年前預測AD的發生。

1.5其他生物標志物 除上述幾大類主要生物標志物外,其他標志物如膠質細胞炎癥反應標志物[33-38],氧化應激(OS)生物標志物[39-42],血液中microRNA[43-47]等同樣有望作為新型生物標志物進行AD早期診斷。

神經炎癥在AD早期發病機制中起重要作用[48-49]。研究表明,小膠質細胞表達的Ⅱ型髓系細胞觸發受體(TREM2),與AD患者小膠質細胞激活和先天性免疫反應有關,可以作為AD早期譜系神經炎癥的潛在標志物[34]。在AD早期,CSF中可溶性水解產物TREM2(sTREM2)水平升高。另一項研究表明,CSF中sTREM2水平與神經元變性和Tau病理學標志物相關,在T-tau陽性個體及具有AD病理學特征的T-tau陰性個體CSF中,sTREM2水平隨時間增加[35]。此外,單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)同樣與AD的發生密切相關。研究表明,血液MCP-1水平在AD早期與神經解剖學具有相關性,較高的MCP-1水平與較差的情景記憶力有關[36]。CSF中MCP-1水平升高可能會加劇AD早期的病理進程[37],MCP-1水平高的AD患者認知能力下降更快。在MCI隊列中,聯合檢測CSF中MCP-1、Tau、P-tau、Aβ可以用來預測MCI發展為AD的可能性。除此之外,其他多項研究表明,CSF中白細胞介素(IL)-1α、IL-6、腫瘤壞死因子α、C-反應蛋白[33,38]等炎性細胞因子均有可能作為潛在生物標志物預測AD的發生。

過度OS產生的自由基,尤其是活性氧(ROS)的過度積累會損壞細胞核、線粒體、蛋白質和核酸等,從而損傷細胞[50]。在AD早期,Aβ沉積及Tau蛋白過度磷酸化造成的神經原纖維纏結會導致過度OS反應,激活AD相關信號通路[51],損傷中樞神經,加速AD的進程[52]。常見的OS標志物有同型半胱氨酸(Hcy)[39]、NADPH氧化酶[42]、8-羥基脫氧鳥苷[40-41]等。Hcy水平的升高會導致線粒體內ROS增加。有研究發現,在平均隨訪9.5年的7 274例受試者中,最終發展為AD與未發展為AD的個體相比,Hcy水平顯著升高,較高的Hcy水平會增加老年人患AD的風險[39]。NADPH氧化酶是ROS的主要來源。有研究表明,NADPH氧化酶與個體認知狀態之間存在很強的相關性,酶活性增加會導致認知下降,與健康人相比,MCI隊列中NADPH氧化酶的活性增加,并在AD隊列中保持升高[42]。

microRNA是一類內源性、非蛋白編碼的微小RNA,其通過與靶標信使RNA結合,導致信使RNA降解或抑制信使RNA的翻譯,從而調控基因的表達[53]。大量研究表明,miRNA的異常表達與AD的發生密切相關。如AD患者血清miR-29c-3p、miR-19b-3p[43]、miR-501-3p[44]、miR-223[45]水平下調,miR-455-3p[46]、miR-519[45]水平上調。此外,有研究表明,血漿miR-411[47]水平隨著AD的發展明顯升高,其可以有效區分MCI與輕度、中度和重度AD患者。

2 AD蛋白標志物的高靈敏度分析技術

在AD早期,只有少量蛋白標志物能夠從CSF穿越血腦屏障進入外周循環,其在血液中豐度極低(fM級),傳統免疫分析方法無法實現精準定量分析[54-55]。因此,如何在AD發病早期,實現血液中超微量蛋白標志物的精準定量分析,是目前利用血液蛋白標志物進行AD無創早期診斷面臨的關鍵挑戰。近年來發展的一些蛋白標志物分析新技術,其靈敏度大大提高,被廣泛應用于神經疾病研究領域。

2.1單分子免疫技術 Quanterix公司基于單分子免疫陣列技術的Single-Molecule Arrays(Simoa)系統是最具有代表性的超靈敏蛋白檢測方法[56],其主要原理是以每個微珠為獨立的反應單元,依據泊松分布,在每個微珠表面負載一個或零個免疫復合物,將微珠分散裝載到飛升級別的微孔陣列中,每個微孔只能容納一個微珠,含有酶標記免疫復合物的微孔會發生單分子引發的酶促反應,產生局部高濃度的熒光產物,統計具有熒光信號的陽性微孔個數,即可實現數字式高靈敏度蛋白分子的定量分析[9]。

與基于檢測整個反應體系輸出的模擬信號的傳統酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測模式相比,數字式ELISA檢測模式克服了傳統模式在靶標蛋白水平很低時,檢測信號被大量擴散和稀釋,檢測信號無法被有效辨識、方法靈敏度受到顯著限制的缺點[57]。即使待測樣本中靶標蛋白水平極低,只要蛋白分子被微孔捕獲并引發單分子酶促反應,陽性熒光微孔就可被識別統計。Simoa技術可以實現低水平蛋白標志物的靈敏準確分析,其靈敏度比傳統ELISA提升了1 000倍以上,且結果更加準確。因此該系統常被用于超微量蛋白標志物的準確靈敏檢測,尤其是神經系統疾病血液標志物的分析[58]。

此外,基于單分子檢測技術(SMC)的Erenna單分子免疫檢測平臺在檢測低豐度蛋白標志物時也體現出廣闊的應用前景[59-60]。SMC技術基于傳統的三明治夾心免疫分析方法,在磁珠表面形成免疫復合物,經過洗脫步驟,將熒光標記的檢測抗體洗脫下來。激光的聚焦效應會形成一個非常狹小的檢測空間“愛里斑”。這個空間集中了多達84%的激光能量,當洗脫下來的熒光標記的檢測抗體通過高能量“愛里斑”時,超過閾值的熒光信號被共聚焦成像系統統計為陽性信號,通過計數陽性信號,可以實現靶標蛋白的數字式高靈敏度分析。該技術融合了獨特的洗脫步驟和可靠的數字計數,與傳統免疫檢測技術相比,信噪比有了顯著的改善,大大提高了檢測靈敏度,被廣泛用于超微量蛋白標志物的靈敏檢測。

2.2Meso Scale Discovery(MSD) 基于電化學發光的MSD技術也被廣泛用于超高靈敏度蛋白標志物分析[61]。該技術的主要原理如下:在石墨電極微孔板里包被捕獲抗體,加入靶標蛋白和釕復合物標記的檢測抗體,形成免疫復合物,釕復合物能夠在氧化電極上產生電化學信號,從而實現靶標蛋白的定量分析[10]。該技術的樣本用量只需25 μL,不僅可以實現低至0.05 pg/mL檢測限的高靈敏度蛋白分析,還可以通過點陣技術,在石墨電極板里實現每孔同時檢測10個指標、4個數量級的寬動態檢測范圍[62]。因此,MSD技術常用于檢測血液中的微量蛋白質生物標志物[63]。

2.3免疫沉淀聯合質譜分析技術(IP-MS) IP-MS在分析外周血AD生物標志物中表現出廣闊的應用前景[13-14]。該方法首先通過免疫沉淀技術,利用抗體的特異性親和力,從豐富的血漿蛋白中分離和富集靶標蛋白及內標蛋白,然后利用質譜儀檢測靶標蛋白水平,對質譜結果的內標蛋白信號進行歸一化處理,最終換算得到靶標蛋白水平。如在SCHINDLER等[13]研究中,利用IP-MS實現了血漿Aβ的高靈敏度分析,其具體原理如下:來源于人體內的天然Aβ包含有14N同位素標記的氨基酸,將一定濃度15N標記的內標Aβ加入待測血漿中,利用免疫沉淀分離富集靶標蛋白Aβ,然后利用質譜儀檢測靶標蛋白Aβ,得到Aβ同工型(Aβ38、Aβ40和Aβ42)的每個同位素(14N和15N)的質譜圖,對所選靶標蛋白的離子峰面積進行求和。Aβ42水平計算公式為:14N同位素標記的Aβ42離子峰面積總和除以15N同位素標記的Aβ42離子峰面積總和乘以15N標記的內標Aβ42水平,用同樣的方法計算Aβ40水平。最終得到的Aβ42/Aβ40比值可用于腦淀粉樣變性的預測。

3 小 結

本文探討了一系列存在于外周血中的AD早期標志物及其高靈敏度分析方法。在眾多生物標志物中,研究最廣泛且最有可能成為未來AD早期診斷發展方向的標志物有Aβ42/Aβ40、特定位點P-tau蛋白(P-tau181、P-tau217、P-tau231)及NLF。其中,Aβ42/Aβ40可以很好地反映大腦中淀粉樣蛋白狀態,特定位點P-tau蛋白在區分AD和其他神經退行性疾病上具有獨特的優勢,NFL在預測病情發展及藥物試驗預后監測中具有很好的診斷效果。此外,近年來超靈敏蛋白分析技術的快速發展,使得外周血中多種極低含量生物標志物的準確聯合檢測成為可能,這對于實現AD早期診斷具有非常重要的臨床意義。

雖然有關AD患者外周血中生物標志物的研究已經取得了一系列成果,但仍存在一些亟須解決的問題:(1)由于樣本數量受限,部分研究中生物標志物的準確性還未被廣泛充分驗證,仍需要擴大樣本量繼續進行研究驗證;(2)部分研究時間不夠,需要繼續密切關注患者疾病發展情況,進行多年縱向研究;(3)需要更多的研究來確定如何最優地結合多種生物標志物進行綜合分析,如Aβ42/Aβ40、P-tau、NFL及其他生物標志物或結合個體突變基因、認知測試進行系統分析;(4)每個實驗室所使用的血液樣本處理操作程序和標志物檢測手段不同,需要統一操作程序和檢測方法,提高研究結果的重復性和可靠性。

外周血中AD相關生物標志物研究正在朝著臨床應用發展,但明確AD不同發展階段、各個生物標志物的臨床診斷臨界值,并應用于AD早期診斷仍有很長一段路要走。相信隨著AD生物標志物研究的更加深入及檢測技術和評估方案的進一步提升,AD血液生物標志物在AD早期診斷和干預、抗AD藥物研發、預后等方面將體現出廣闊的應用前景。