生物制藥專業(yè)微生物學(xué)研究性實(shí)驗(yàn)教學(xué)的探索

田 園

（山東第一醫(yī)科大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271016）

生物制藥專業(yè)作為與新興技術(shù)、傳統(tǒng)專業(yè)交叉融通發(fā)展的新工科專業(yè)，承擔(dān)著為生物健康產(chǎn)業(yè)培育和輸送具有綜合素質(zhì)的高質(zhì)量應(yīng)用型人才的重任。隨著我國(guó)實(shí)行創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)發(fā)展戰(zhàn)略、“中國(guó)制造2025”“互聯(lián)網(wǎng)+”、“大眾創(chuàng)業(yè)、萬眾創(chuàng)新”、新舊動(dòng)能轉(zhuǎn)換等國(guó)家發(fā)展戰(zhàn)略，社會(huì)各界對(duì)創(chuàng)新型人才的需求也越來越大。創(chuàng)新型人才是由教育培養(yǎng)產(chǎn)生的［1］，涵蓋教學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，課堂教學(xué)與實(shí)踐教育是培養(yǎng)人才的前沿平臺(tái)。

“微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)”是一門具有較強(qiáng)應(yīng)用性和實(shí)踐性的課程，對(duì)醫(yī)學(xué)院校生物制藥專業(yè)而言是十分重要的專業(yè)基礎(chǔ)課。隨著普通高等學(xué)校本科階段教學(xué)整體質(zhì)量改革與專業(yè)教學(xué)改革試點(diǎn)工程的持續(xù)推進(jìn)，很多高校已經(jīng)進(jìn)行了“微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)”課程的教學(xué)改革，通過整合優(yōu)化教材實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及編排，增強(qiáng)學(xué)科實(shí)驗(yàn)活動(dòng)的綜合性和探究性，激發(fā)學(xué)生自主學(xué)習(xí)的興趣，提高學(xué)生的綜合素質(zhì)和創(chuàng)新能力［2-4］。“微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)”課程有利于學(xué)生進(jìn)行較大規(guī)模的自主設(shè)計(jì)型研究性實(shí)驗(yàn)，對(duì)穩(wěn)步提高學(xué)生的綜合專業(yè)素質(zhì)、全面培養(yǎng)學(xué)生的科研創(chuàng)新能力具有重要作用。

在“微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)”中，不同環(huán)境中的微生物分離實(shí)驗(yàn)屬于常規(guī)基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)，近年來，很多高校在實(shí)驗(yàn)方法上進(jìn)行了相應(yīng)的調(diào)整與改革［5-6］。作為醫(yī)學(xué)院校，我們一直在積極探索既能利用自身特色又能培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力的實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新模式。近年來，植物內(nèi)生菌因其種類的多樣性和良好的生物活性而備受關(guān)注。我校校園植被豐富，學(xué)校有“百草園”中藥植物種植園，作為每年的微生物菌株分離實(shí)驗(yàn)的來源之一。泰山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)有著極其豐富的野生植物資源，是植物內(nèi)生菌研究材料的理想來源。我們?cè)O(shè)計(jì)了以“植物內(nèi)生菌資源的開發(fā)利用”為主題的綜合研究性實(shí)驗(yàn)，著力培養(yǎng)學(xué)生的科研思維、創(chuàng)新能力，提高學(xué)生的綜合素質(zhì)。

一、教學(xué)目標(biāo)

（一）培養(yǎng)學(xué)生實(shí)踐動(dòng)手能力

學(xué)生能在藥用植物園或者泰山親自動(dòng)手采集植物樣品，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行植物內(nèi)生菌的分離，既能滿足學(xué)生探究求知的好奇心，又能進(jìn)一步培養(yǎng)他們的實(shí)踐動(dòng)手能力。

（二）加深學(xué)生對(duì)知識(shí)點(diǎn)的綜合理解

研究性實(shí)驗(yàn)所涉及的實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括微生物學(xué)的無菌操作、顯微觀察、分離純化和菌的保存等基本操作技術(shù)，此外還有分子生物學(xué)和生物化學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)。學(xué)生經(jīng)過實(shí)踐，可以掌握并綜合利用這些實(shí)踐技能，對(duì)微生物資源的利用和微生物的多樣性有更加深入的了解。

（三）培養(yǎng)學(xué)生的科研精神和創(chuàng)新能力

研究性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過程中，難免會(huì)遇到一些新問題，學(xué)生通過自主查閱文獻(xiàn)，學(xué)會(huì)獨(dú)立解決相關(guān)問題，能夠培養(yǎng)學(xué)生不怕挫折、敢于探索的科研精神；整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果、撰寫實(shí)驗(yàn)論文的過程，能夠較好地提高學(xué)生的創(chuàng)新能力。

二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

植物內(nèi)生菌的分離、鑒定和保藏的學(xué)時(shí)數(shù)為16學(xué)時(shí)，每學(xué)期的實(shí)驗(yàn)人數(shù)在50人左右，每班10個(gè)組，每組4～5人。學(xué)生利用課外時(shí)間提前自行采集藥用植物，開課時(shí)進(jìn)行分菌工作。引申實(shí)驗(yàn)不在16學(xué)時(shí)內(nèi)，主要針對(duì)有興趣繼續(xù)研究菌株的分類鑒定或生物活性的學(xué)生，每年參與引申實(shí)驗(yàn)的學(xué)生為10人左右，5人為一組，以科研小項(xiàng)目的形式進(jìn)行，通常需要一學(xué)年的時(shí)間。

（一）培養(yǎng)基

參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》［7］附錄制備培養(yǎng)基，分別配制牛肉膏培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和高氏1號(hào)培養(yǎng)基，用于分離植物內(nèi)生細(xì)菌、霉菌和放線菌。

（二）藥用植物內(nèi)生菌的分離純化

取新鮮的藥用植物組織（根、莖、葉、花、種子等），采用組織塊培養(yǎng)法對(duì)植物內(nèi)生菌進(jìn)行分離與純化［8］，具體操作如下：第一步，用自來水將植物表面沖洗干凈；第二步，在5%（V/V）次氯酸鈉溶液中浸泡5 min，隨后用無菌水漂洗4次并用無菌濾紙吸去殘留水；第三步，用75%的乙醇溶液浸泡5 min，用無菌水漂洗4次并吸去殘留無菌水；最后，將組織切成直徑5 mm的小塊，接種到固體培養(yǎng)基上。

分離純化細(xì)菌時(shí)，平板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3天，將組織塊周圍生長(zhǎng)的細(xì)菌菌斑用接種環(huán)挑取到牛肉膏培養(yǎng)基上，采用四區(qū)劃線法反復(fù)純化直至獲得純凈菌株。分離霉菌和放線菌時(shí)，平板置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7天，將組織塊周圍生長(zhǎng)的菌絲用接種環(huán)挑取到相應(yīng)的培養(yǎng)基上，采用四區(qū)劃線法反復(fù)純化直至獲得純凈菌株。

（三）內(nèi)生菌的形態(tài)學(xué)鑒定

菌落形態(tài)觀察：觀察內(nèi)生菌在固體培養(yǎng)基上的菌落顏色、邊緣形狀和生長(zhǎng)速度。

參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》在第二周和第四周的內(nèi)容，對(duì)內(nèi)生菌進(jìn)行顯微形態(tài)觀察：細(xì)菌采用革蘭氏染色法［7］30-33進(jìn)行觀察，確定菌株為革蘭氏陽性菌還是革蘭氏陰性菌。放線菌和真菌分別采用插片培養(yǎng)和載片培養(yǎng)觀察［7］51-54。

（四）內(nèi)生菌的保藏

參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》在第十三周的內(nèi)容［7］165-166，真菌和放線菌采用斜面保藏法，細(xì)菌采用甘油保藏法。實(shí)驗(yàn)過程中一定要注意無菌操作。

（五）結(jié)果與分析

內(nèi)生菌分離：要挑選不同形態(tài)的菌進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，以確保分離獲得的菌的種類數(shù)盡量多。另外，為保證分到的菌是內(nèi)生菌，應(yīng)將最后一次漂洗植物組織的水涂布于固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)3～7天后沒有細(xì)菌或真菌長(zhǎng)出，表明分離獲得菌是內(nèi)生菌，而不是環(huán)境中污染的菌。

內(nèi)生形態(tài)學(xué)鑒定：為確保細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果正確，應(yīng)采用混菌染色法，即將分離獲得的內(nèi)生菌與已知的大腸埃希氏菌（G-）和四聯(lián)球菌（G+）混合染色，若兩個(gè)已知菌的染色結(jié)果正確，則能避免因操作不當(dāng)引起的錯(cuò)誤結(jié)果。觀察放線菌時(shí)，應(yīng)特別注意放線菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲的粗細(xì)和顏色差異；放線菌的生長(zhǎng)速度慢，培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，在操作中應(yīng)特別注意無菌操作，嚴(yán)防雜菌污染。觀察真菌時(shí)，要重點(diǎn)觀察標(biāo)本中氣生菌絲和產(chǎn)孢子結(jié)構(gòu)的形態(tài)及特征性構(gòu)造，如曲霉的頂囊、足細(xì)胞，青霉的帚狀枝等。

通過上述內(nèi)生菌的分離和鑒定工作，學(xué)生需對(duì)比不同植物或相同植物不同組織部位的微生物的種類和數(shù)量有何不同，記錄這些差異并進(jìn)行討論。

（六）引申實(shí)驗(yàn)

隨著分子生態(tài)學(xué)等研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)已經(jīng)開發(fā)和鑒定的微生物菌種僅占微生物總體數(shù)量的1%左右，仍有極其豐富的未知微生物種群待開發(fā)［9］。從一些條件特殊的生態(tài)環(huán)境中更有可能分離到新的菌株，以及有重要應(yīng)用價(jià)值的菌株。植物內(nèi)生菌在與植物長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，形成了獨(dú)特的生理和代謝機(jī)制，更易產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，是尚未被完全開發(fā)的微生物資源［10-11］。

對(duì)已經(jīng)獲得的植物內(nèi)生菌進(jìn)行菌株的進(jìn)一步鑒定，包括生理生化特征、16S rRNA基因測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，得到序列后在GenBank中進(jìn)行序列比對(duì)，一致性小于97%的即為新菌種。分離到新菌種后，可就所做的工作和數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，發(fā)表文章。也可以對(duì)分離獲得的內(nèi)生菌進(jìn)行生物活性研究，包括發(fā)酵液的制備和萃取，粗提物的抗細(xì)菌、抗真菌、抗氧化研究，獲得活性結(jié)果后，可從活性方面進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理，發(fā)表文章。

對(duì)學(xué)生而言，不僅進(jìn)行了科研的鍛煉，同時(shí)還培養(yǎng)了學(xué)術(shù)論文的撰寫能力，發(fā)表核心期刊論文及SCI等高質(zhì)量的學(xué)術(shù)論文。近幾年，我專業(yè)本科生作為第一作者或參與作者發(fā)表的有關(guān)微生物資源開發(fā)利用方面的論文有10余篇，其中SCI收錄的論文3篇，如表1所示。

表1 近幾年我院本科生發(fā)表的關(guān)于微生物資源開發(fā)和利用的論文

結(jié)語

本研究性實(shí)驗(yàn)的目的旨在讓學(xué)生了解植物樣品采集、植物內(nèi)生菌分離純化、鑒定和保藏的基本方法，學(xué)習(xí)一系列微生物的基本操作技術(shù)。利用本課程的特點(diǎn)，將部分原本需要教師準(zhǔn)備的實(shí)驗(yàn)樣本改為由學(xué)生親自采集，并將采集范圍從熟悉的校園擴(kuò)至野外，不僅極大地提高了實(shí)驗(yàn)的樂趣和學(xué)生的參與熱情，還讓學(xué)生從源頭上理解了實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹＿@項(xiàng)微生物學(xué)的探究性實(shí)驗(yàn)具有較強(qiáng)的可操作性，費(fèi)用沒有增加，且極大地激發(fā)了學(xué)生的興趣，取得了很好的教學(xué)成效。我專業(yè)以這種形式開展微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)已有6年，不少學(xué)生還通過參與引申實(shí)驗(yàn)，提升了微生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的綜合運(yùn)用能力，初步體驗(yàn)了科學(xué)研究的具體流程，有些還取得了不錯(cuò)的研究結(jié)果，建立和培養(yǎng)了科研創(chuàng)新意識(shí)和自主創(chuàng)新能力。

本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)有兩個(gè)：其一，植物內(nèi)生菌本身是較新的一類微生物菌種資源，更易從中發(fā)現(xiàn)新的菌種或有活性的菌種，本科生經(jīng)歷了從常規(guī)的分離、形態(tài)觀察到科研實(shí)驗(yàn)（新菌種的分離、分子生物學(xué)鑒定或活性測(cè)定）的過程，可以發(fā)表核心期刊或SCI論文。學(xué)生認(rèn)識(shí)到從本科實(shí)驗(yàn)衍生到科研實(shí)驗(yàn)并不是非常困難的事情，消除了學(xué)生對(duì)科研的畏懼感和神秘感，提高了學(xué)生對(duì)科研的興趣和自信，培養(yǎng)了學(xué)生的科研能力、創(chuàng)新意識(shí)和創(chuàng)新能力。其二，使共性教學(xué)轉(zhuǎn)變?yōu)閭€(gè)性化培養(yǎng)。學(xué)生全部共同完成了植物內(nèi)生菌的分離、形態(tài)觀察和保藏實(shí)驗(yàn)，有興趣的學(xué)生可以繼續(xù)利用獲得的微生物進(jìn)行分類鑒定和活性篩選，有些學(xué)生還采集自己家鄉(xiāng)的特有植物進(jìn)行內(nèi)生菌的分離鑒定工作。本實(shí)驗(yàn)使單純的微生物分離實(shí)驗(yàn)衍生為有難度、復(fù)雜的科研實(shí)驗(yàn)，使對(duì)于學(xué)生的培養(yǎng)從大眾化的共性培養(yǎng)逐步轉(zhuǎn)化為個(gè)性化的有興趣、有潛力的培養(yǎng)和挖掘。