改進HPLC-ICP-MS法測定食品中的無機砷

劉立秋

（中國檢驗認證集團上海有限公司，上海 201201）

砷存在多種形態(tài)，其毒性與存在形態(tài)密切相關(guān)，不同形態(tài)的砷對人體作用差別很大[1]。食品中砷的常見形態(tài)為砷甜菜堿（Arsenic Betaine，AsB）、二甲基砷（Dimethyl Arsenic，DMA）、一甲基砷（Monomethyl Arsenic，MMA）、五價無機砷（AsⅤ）、三價無機砷（AsⅢ）。無機砷的毒性大于有機砷，而無機砷中AsⅢ的毒性又遠遠大于AsⅤ[2-3]，甲基化的砷毒性較小，而AsB被認為是無毒的，其毒性從大到小依次為AsⅢ＞AsⅤ＞MMA＞DMA＞AsB[4]。不同種類的食品中砷形態(tài)組成差別較大，總砷含量較大的食品可能無機砷的含量很小，因此進行砷的形態(tài)分析比單純用砷的總量評價食品安全性更具科學性。目前，高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法（High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，HPLC-ICP-MS）是《食品安全國家標準 食品中總砷及無機砷的測定》（GB 5009.11—2014）[5]規(guī)定的測定食品中無機砷的方法，但在實際工作中參照國標規(guī)定的方法條件測定食品中的無機砷具有一定局限性，無法完全分離DMA和AsⅢ的色譜峰，會出現(xiàn)無機砷檢測值偏高或假陽性結(jié)果。本研究通過改變流動相組成及洗脫程序優(yōu)化了HPLC-ICP-MS方法，能使DMA和AsⅢ色譜峰完全分離開，不同種形態(tài)砷的色譜峰分離度得到了提高。為進一步驗證該改進方法測定食品中無機砷的可靠性，采用無機砷空白米粉作為樣品基質(zhì)，對其無機砷的檢出限進行測定，并進行精密度和回收率分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260液相色譜-Agilent 7700X電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用儀（安捷倫科技有限公司）；CEM MARS 2微波消解儀（美國CEM公司）；飛鴿GL-20G-II高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）。

砷甜菜堿、二甲基砷、一甲基砷標準溶液（中國計量科學研究院）；AsⅤ、AsⅢ標準溶液（o2si公司）；氬、氦，均為99.999%；超純水（電阻率達到18.25 MΩ·cm）；無水乙酸鈉、磷酸二氫鈉、硝酸鉀、乙二胺四乙酸二鈉、碳酸銨、氨水、乙酸和無水乙醇，均為優(yōu)級純；儀器調(diào)諧液：濃度各為1 μg·L-1的Li、Y、Ce、Tl、Co混合溶液。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

稱取已制備好的米粉1.0 g（準確至0.001 g），置50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL 0.15 mol·L-1HNO3溶液，放置過夜。置90 ℃恒溫箱中熱浸提2.5 h，每0.5 h振搖1 min。提取完畢，取出冷卻至室溫，8 000 r·min-1離心15 min，取上層清液，經(jīng)0.45 μm有機濾膜后進樣測定，同時做空白試驗。

1.2.2 儀器工作條件

（1）液相色譜工作條件。①GB 5009.11—2014標準提供的液相色譜工作條件。流動相C為10 mmol·L-1無水乙酸鈉+3 mmol·L-1硝酸鉀+10 mmol·L-1磷酸二氫鈉+0.2 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉緩沖液+1%乙醇，用氨水調(diào)節(jié)pH＝10.0；色譜柱為HAMILTON PRP-X100 10 μm COL 250 mm×4.1 mm；流動相流速為1.0 mL·min-1，進樣體積為20 μL，洗脫方式為等度洗脫。②本研究改進后的液相色譜工作條件。流動相A為0.1 moL·L-1碳酸銨+2%甲醇，用氨水或乙酸調(diào)pH值，使pH=8.8～9.0；流動相B為2%甲醇水溶液；色譜柱為HAMILTON PRP-X100 10 μm COL 250 mm×4.1 mm（與改進前的實驗使用同一根色譜柱）；流動相流速為1.0 mL·min-1，進樣體積為20 μL，洗脫方式為梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

（2）ICP-MS工作條件。射頻功率為1 500 W，等離子體氣流量為15 L·min-1，霧化器流量為1.00 L·min-1，氦氣流量為（碰撞池）4.5 mL·min-1，霧化室溫度為2 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗條件改進結(jié)果

圖1為使用GB 5009.11—2014標準的流動相和洗脫程序形成的色譜圖，圖2為使用改進后的流動相和洗脫程序形成的色譜圖，兩色譜圖的進樣溶液（AsB、DMA、MMA、AsⅤ和AsⅢ）濃度均為50 μg·L-1。從圖1、圖2可以看出，使用GB 5009.11—2014標準的流動相和洗脫程序形成的色譜圖中，DMA和AsⅢ色譜峰重疊在一起，而使用改進后的流動相和洗脫程序形成的色譜圖分離度很好，能把DMA和AsⅢ色譜峰完全分離開。

圖1 GB 5009.11—2014標準方法的色譜圖

圖2 改進方法的色譜圖

通常，色譜柱使用時間越長，柱效會越差，不同批次的同一類色譜柱，柱效也不一樣，當色譜柱柱效不能滿足實驗的分離度時，可以通過改變洗脫程序中流動相的比例來調(diào)整和優(yōu)化。流動相中碳酸銨的濃度越高，各組分的保留時間越短，因此可以通過調(diào)節(jié)流動相中碳酸銨的比例來調(diào)節(jié)各組分的保留時間和分離度。實驗過程中分離度不好時，適當增加流動相B的比例，可以提高各色譜峰的分離度，以滿足檢測要求。

2.2 方法的線性考察

取適量的AsⅤ和AsⅢ標準溶液，用超純水制備成濃度為2.5 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、50.0 μg·L-1和100.0 μg·L-1的系列標準溶液，使用改進后的HPLC-ICP-MS方法檢測，得到標準曲線回歸線方程。AsⅢ：y=8 029.912 821x，相關(guān)系數(shù)R=0.999 3；AsⅤ：y=12 993.529 5x+6 024，相關(guān)系數(shù)R=0.999 3。由此可知，在2.5～100.0 μg·L-1，該方法的線性相關(guān)性很好。

2.3 方法檢出限的測定

稱量空白米粉7份，每份1.0 g，在7份空白米粉中各加入10 μL 1 000 μg·L-1的AsⅢ和AsⅢ混合標準溶，按1.3.1進行處理，采用流動相改進的HPLCICP-MS方法測定。根據(jù)3倍信噪比確定檢出限，檢出限=3X/（S/N），其中X=10×1 000/1.0=0.01 mg·kg-1，米粉AsⅢ檢出限為0.002 8 mg·kg-1，米粉AsⅤ檢出限為0.003 2 mg·kg-1，而GB 5009.11—2014標準中米粉的檢出限為0.01 mg·kg-1，可見流動相改進后的方法檢出限更低。AsⅢ、AsⅤ檢出限測定結(jié)果見表2。

表2 檢出限測定結(jié)果

2.4 方法精密度與回收率的測定

稱量空白米粉22份，每份1.0 g，1份空白米粉不加標，其余21份空白米粉分3組7平行分別加入1 000 μg·L-1的標準混合溶液50 μL、100 μL、500 μL，按1.3.1進行處理，采用改進的HPLC-ICPMS法測定精密度與回收率，結(jié)果見表3。方法回收率為92.4%～95.4%，精密度（RSD）為1.41%～2.70%，符合相關(guān)標準要求。

表3 精密度與回收率測定結(jié)果（n=7）

3 結(jié)論

砷的毒性與其形態(tài)密切相關(guān)，無機砷有劇毒，有機砷則幾乎無毒，砷的形態(tài)分析對于食品安全的研究具有重大意義。按照GB 5009.11—2014規(guī)定的流動相及洗脫程序測定食品中的無機砷，會出現(xiàn)DMA和AsⅢ色譜峰重疊，致使無法準確測定食品中無機砷的含量，因此本研究對該方法的流動相和洗脫方式進行了改進。使用改進后的HPLC-ICP-MS法測定食品中的無機砷，各峰分離度高，能把DMA和AsⅢ完全分離開來，提高了無機砷檢測的準確性。相對于國標方法，改進后的流動相組成簡單且不含鈉鹽，對色譜柱損害小，靈敏度更高。本研究采用米粉作為樣品基質(zhì)，對該方法的線性、檢出限、精密度和回收率進行了考察，結(jié)果顯示，在無機砷濃度為2.5～100.0 μg·L-1時，該方法的線性相關(guān)性很好，檢出限比改進前低很多，精密度和回收率良好。