PRRSV、CSFV、PRV和PCV2四重實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應用

李 欣,楊 莉,劉光亮,王文秀,劉海隆,曹宗喜,張 艷*

(1.新疆農業大學動物醫學學院,新疆烏魯木齊 830052;2.海南省農業科學院畜牧獸醫研究所,海南海口 571100;3.海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室,海南海口 571100;4.山東省濱州畜牧獸醫研究院,山東濱州 256600)

在集約化養豬的典型條件下,豬群經常同時感染一種或多種病毒[1]。引起豬呼吸道疾病的病毒包括豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)[2]、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)[3]、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)[4]、豬圓環病毒(Porcine circovirus,PCV)[5]。豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬病及豬圓環病毒病的臨床癥狀相似[6],多種病原混合感染時更難確診,建立一種特異、靈敏、快速及量化的檢測方法用于臨床診斷十分必要。常規的病原檢測方法靈敏度和病原含量測定等存在不足[7,8]。多重熒光定量PCR需將多種熒光基團進行組合,實現檢測多個靶標的目的[9],該方法靈敏度高、重復性好、檢測耗時較短[10]。為快速、準確診斷豬常見呼吸道疫病,本研究擬建立一種同時檢測PRRSV、CSFV、PCV2和PRV 4種病毒單一或混合感染的四重實時熒光定量PCR方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及樣品 PRRSV、CSFV、PRV、PCV2均來自于海南省農業科學院畜牧獸醫研究所實驗室;豬傳染性胃腸炎+豬流行性腹瀉+豬輪狀病毒(G5型)三聯活疫苗(弱毒華毒株+弱毒CV 777株+NX株),哈爾濱維科生物技術有限公司產品;豬乙型腦炎活疫苗(SA14-14-2株),中牧實業股份有限公司產品;樣品采集自海南省豬場和屠宰場,共計298份。

1.1.2 主要試劑 MiniBEST Viral RNA/DNA提取試劑盒 Ver.5.0(9766),ExTaq、pMDTM19-T Vector Cloning Kit(6013),Hind Ⅲ(1060A),PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA合成試劑盒(6210B),E.coliDH5α Competent Cells(9057),Premix ExTaqTM(Probe qPCR)(RR390B),DNA標準DL 1 000(3591Q),DNA標準DL 5 000 (3428Q) ,寶生物工程(大連)有限公司產品;通用型DNA純化回收試劑盒(DP214)、質粒小提試劑盒(DP103),天根生化科技(北京)有限公司產品。……