酸菜汁中白地霉菌的分離純化與鑒定

張明玉，盧志鋒

（1.葫蘆島市檢驗檢測中心，遼寧葫蘆島 125000；2.齊齊哈爾大學，黑龍江齊齊哈爾 161000）

白地霉是真核微生物，形態特征介于酵母菌和霉菌之間，具有生態適應性強、生長速度快的屬性，在土壤、泡菜中分布廣泛[1-2]。酸菜是一種含有豐富乳酸菌的腌漬蔬菜制品。酸菜采用自然接種發酵工藝，除了含有優勢菌群外還富含其他菌體，以傳統生理生化方法與分子生物學方法對白地霉進行分離菌株鑒定，為多角度開發利用東北酸菜中的微生物資源，發展相應微生態制劑及深入研究其開發利用價值奠定基礎[3]。本文主要研究自然發酵酸菜中白地霉的分離與鑒定，通過觀察菌落形態以及PCR擴增技術對菌種進行一系列的鑒定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

蒸汽滅菌器、DRP-9052電熱恒溫培養箱、X52-G顯微鏡、HZQ-QX恒溫振蕩器、離心機、pH計、分光光度計；緩沖液、溶菌酶、20% SDS（十二烷基硫酸鈉）、電泳緩沖液。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌落的鑒定

菌種初篩復篩。取10.0 g自然發酵的酸菜，將其裝入含有90 mL無菌水的無菌三角燒瓶中，充分振蕩混勻。對混合均勻的上清液進行梯度稀釋，即將1 mL上清液裝入含有9 mL無菌水的無菌試管中，稀釋梯度為10-1，振蕩混勻后，在稀釋梯度10-1中取1 mL液體，裝入含有9 mL無菌水的無菌試管中，稀釋梯度為10-2，依次類推。于10-2、10-3和10-4的試管中分別取200 μL液體，涂布于馬鈴薯培養基中，于30 ℃恒溫培養48 h。

將生長良好的菌株劃線培養，得到單菌落。挑取單菌落菌種，接種于10 mL無菌生理鹽水，梯度稀釋后，在10-2、10-3稀釋梯度下，取200 μL涂布于馬鈴薯固體培養基，于30 ℃恒溫培養48 h，觀察菌落形態。

1.2.2 個體形態的鑒定

在加入乳酸-石碳酸棉蘭染液的載玻片中用鑷子加入從菌落邊緣夾取的少許菌絲體。加蓋玻片，放置在顯微鏡下，觀察營養體和繁殖體的特征。

1.2.3 分子生物學鑒定

（1）DNA的提取。使用細菌基因組DNA提取試劑盒進行提取，具體步驟參照說明書。

（2）PCR擴增。PCR反應體系組成見表1。NL1引物序列為GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG，TM=58.55 ℃；NL4引物序列為GGT CCG TGT TTC AAG ACG G，TM=59.72 ℃。

表1 PCR反應體系組成表

將上述組分加入PCR管中，反應的總體系為25 μL，在PCR儀上進行擴增反應。經梯度PCR實驗選定最佳退火溫度為54 ℃，反應熱循環參數為94 ℃預變性4 min，94 ℃變性40 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，共35個循環，最后72 ℃延伸10 min[4]。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物[5]。擴增結束后，PCR產物-20 ℃保存。采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進行目的片段的回收。

（3）測序及Blast處理。由上海生物工程技術服務有限公司純化PCR擴增產物后測序。將測序結果輸入GenBank數據庫，利用BLAST軟件，與數據庫中已發表基因序列進行序列比對，從而最終確定目的基因的同源性。

（4）構建進化樹圖。通過綜合使用Clustalx1.83、BioEdit7.0、Mega 4.13種軟件進行建樹，雖然單獨使用Clustalx也能達到建樹效果，但Mega 4.1結果更加細致，因此采用結合使用的方式[6]。

2 結果與分析

2.1 菌落鑒定結果

24 h后觀察涂布好的菌落，菌落生長快，呈現白色平面擴散狀，較扁平；48 h后觀察菌落，呈現短絨狀或近于粉狀，菌絲體變得緊密整齊，菌絲白色；72 h后菌絲生長開始緩慢，不再向四周擴散，有同心圈可放射線，有的呈中心突起。24 h和72 h后的菌落分別如圖1所示。

圖1 菌落圖

2.2 個體形態鑒定結果

菌絲寬3～6 μm（圖2），節孢子大小為（5.5～7.3 μm）×（6.5～15.9 μm）（圖3）。

圖2 菌絲圖

圖3 節孢子

2.3 PCR擴增電泳以及回收產物電泳圖

由圖4（a）可知，26S rDNA的PCR擴增產物目標大小約為600 bp，與本試驗結果一致；由4（b）可知，PCR膠回收產物條帶清晰可見，可用于后續的實驗研究。

2.4 Mega 4.1進化樹圖

由圖5和表2可知，待測菌株G.wang的26S rDNA序列與菌株G.geo.7的18S rRNA的部分序列的同源性可達98%以上，且菌株G.geo.7為白地霉菌屬，因此確定目標菌株為白地霉菌株。

圖5 26S rDNA白地霉菌株擴增樹狀圖

表2 26SrDNA序列同源性表

3 結論

本實驗以東北自然發酵酸菜為菌種來源，從中分離純化出菌株G.wang，結合其菌落特征和個體形態特征及分子生物學鑒定。結果發現，G.geo.7與G.wang同源性最高，且同源性能夠達到99%以上。26S rDNA序列同源性分析結果表明，分離株G.wang結合真菌鑒定手冊得知為半知菌亞門-絲孢綱-絲孢目-從梗孢科-地霉屬-白地霉種。