基于網絡藥理學研究紅景天苷治療新生小鼠缺氧缺血性腦損傷的作用機制

陳茹佳,劉建霞,閔加威

新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)是指因圍產期新生兒腦部血流量減少、宮內窘迫、臍帶繞頸等引起的腦組織缺氧缺血性損傷,主要表現有新生兒意識、肌張力改變及原始反射異常,可能引起新生兒死亡和智力低下、癲癇、腦癱等近遠期后遺癥[1],給患兒家庭及社會帶來沉重負擔。目前,臨床上治療HIBD的主要方法有糾正酸中毒、吸氧和亞低溫治療等[2],但這些方法并不能有效修復受損神經細胞,在改善患兒遠期預后方面效果不顯著,故需要開發新的預防或協同治療手段。紅景天苷是中藥薔薇科草本植物紅景天的主要有效成分,本質是苯丙烷類糖苷化合物(C14H20O7),安全性高且藥理作用廣泛。研究表明,紅景天苷通過抑制細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應等途徑發揮抗缺氧、抗氧化、抗炎癥、抗衰老、神經保護等多種藥理作用[3-8],然而紅景天苷在新生兒HIBD中的作用機制尚不明確。網絡藥理學作為一種系統性的醫藥研究新模式,能夠有效建立藥物活性成分與疾病作用靶點之間的內在聯系[9],現已被廣泛應用于探索單一成分或中醫藥制劑發揮藥效的途徑方式[10]?；诖?本研究擬利用網絡藥理學方法,探討紅景天苷治療HIBD的可能機制,解析關鍵作用靶點和信號通路,并通過體內實驗驗證紅景天苷治療新生小鼠HIBD的實際效果,為臨床深入研究紅景天苷治療新生兒HIBD提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料及儀器

1)實驗動物:C57BL/6小鼠購自湖北省實驗動物研究中心[SCXK(鄂)2020-0018],飼養于中南民族大學動物實驗中心,環境溫度18～22 ℃,相對濕度50%～60%,12 h循環照明,飼養密度為每10只小鼠0.09～0.63 m2。

2)藥物與試劑:紅景天苷購自MCE公司;HE染液套裝(G1003)、Bax抗體(2772)、Bcl-2抗體(3498)、Cleaved-caspase-3抗體(9661)購自Cell Signaling Technology(美國)。

3)主要儀器:小動物麻醉機(R500IE);全自動常壓持續性缺氧(富氧)裝置(XBS-03);大小鼠抓力測定儀(YLS-13A);化學發光成像系統(C280)。

1.2 網絡藥理學分析

1)藥物靶點篩選:從PubChem數據庫搜索并下載紅景天苷2D結構的SDF文件和SMILES結構式。將SMILES結構式輸入Similarity Ensemble Approach(SEA)數據庫篩選出藥物相關靶點。使用SDF文件搜索Swiss Target Prediction數據庫和Pharm Mapper數據庫,設置種屬為“Homo sapiens”進行靶點篩選。

2)疾病靶點篩選:使用DisGeNET數據庫、GeneCards數據庫和OMIM數據庫分別以“neonatal hypoxia ischemia brain damage”“neonatal hypoxia ischemia encephalopathy”“neonatal hypoxic ischemic encephalopthy”為關鍵詞進行檢索,將獲得的相關靶點基因合并后刪除重復得到疾病相關靶點。

3)“藥物-疾病”交集靶點篩選:對所有收集到的靶點進行Uniprot ID轉換,統一轉換為“Gene name”。將紅景天苷作用靶點和疾病相關靶點導入Venny 2.1在線軟件做圖工具平臺,繪制韋恩圖,二者取交集后獲得紅景天苷-HIBD交集靶點。

4)潛在靶點蛋白質相互作用(PPI)網絡構建:將紅景天苷-HIBD共同靶點上傳STRING數據庫,將生物種類設定為“Homo Sapiens”,最小互相作用閾值設定為0.4,隱藏不相連蛋白,其余設置為默認,構建PPI網絡。將PPI網絡導入Cytoscape軟件,通過“Network Analyzer”得出相互作用網絡的拓撲學參數,degree排序后,選取degree前10位基因作為核心靶點。

5)GO功能和KEGG通路富集分析:將紅景天苷-HIBD潛在作用靶點導入DAVID數據庫,利用GraphPad Prism軟件,分別從生物過程(BP)、細胞組分(CC)、分子功能(MF)層面進行GO功能富集分析。同時,將潛在作用靶點導入DAVID數據庫,利用微生信在線工具,通過選取前20位通路形成KEGG通路富集分析條形圖,進而找出紅景天苷-HIBD作用關鍵通路。

1.3 實驗驗證

1)模型制備:選取鼠齡10 d、平均體質量5 g的小鼠,基于Rice Vannucci方法[11]建立HIBD模型。用4%異氟烷麻醉小鼠,固定并結扎右側頸總動脈,縫合傷口后回籠恢復。2 h后,將小鼠置于37 ℃、含10%氧氣和90%氮氣的恒溫缺氧箱中缺氧1 h。模型制備完成后,由尾部提起小鼠,當觀察到小鼠頭部產生單側偏轉現象,判斷模型制備成功。

2)實驗分組:將小鼠隨機分為假手術組(n=21)、缺氧缺血組(n=21)、安慰劑組(n=21)和紅景天苷組(n=21)。其中,假手術組僅進行麻醉、在切開暴露右側頸總動脈后直接縫合傷口;缺氧缺血組完成整個模型制備過程;基于文獻調研結果[12-13]和實驗室前期工作,造模后,紅景天苷組按100 mg/kg用二甲基亞砜(DMSO)稀釋紅景天苷后腹部注射給藥1次;安慰劑組不給藥,只腹部注射按100 mg/kg用DMSO稀釋的生理鹽水。

3)TTC染色:造模后24 h,將小鼠過量麻醉處死,剪刀斷頭,剖開頸部皮膚,剪開腦膜,去掉嗅球小腦,取出各實驗組小鼠完整腦組織(n=6),冷凍切片,厚度1～2 mm。配制2%TTC染液,浸沒切片,37 ℃避光孵育10～15 min。孵育完成后,回收染液,滴加4%多聚甲醛至完全覆蓋切片,在4 ℃下固定過夜。使用掃描儀觀察攝片,使用Image-Pro Plus 6.0軟件定量分析梗死區域。

4)HE染色:造模后24 h,將小鼠過量麻醉處死,剪刀斷頭,剖開頸部皮膚,剪開腦膜,去掉嗅球小腦,取出各實驗組小鼠完整腦組織(n=3),制備石蠟切片進行HE染色。脫蠟后,使用蘇木素染液染色3～5 min,分化返藍后流水沖洗。梯度乙醇脫水后,使用伊紅染液染色5 min,再次脫水后用中性樹膠封片。染色結束后,細胞核呈藍色,細胞質呈紅色。使用尼康DS-U3相機×20物鏡在頂葉皮層、海馬CA1區域采集圖像。

5)Western blot:造模后24 h,將小鼠過量麻醉處死,剪刀斷頭,剖開頸部皮膚,剪開腦膜,去掉嗅球小腦,收集各實驗組小鼠腦損傷側腦組織(n=6),加入裂解液,獲取裂解液混合物。4 ℃下15 000 r/min離心15 min,獲得上清。將上清與5×loading buffer按4︰1混合煮沸,獲得所需樣品。采用雅酶快速配膠試劑盒配制電泳凝膠,跑電泳轉膜后,獲得目的條帶,并用一抗、二抗孵育。利用化學發光成像系統進行顯影,使用Quantity One 4.6.1軟件對獲取的蛋白印記進行分析。

6)運動神經行為評估:在造模后21 d開展行為學測試,各實驗組小鼠(n=6)按照順序完成Y迷宮實驗[14-16]、拉力測試[17]和角落實驗[18],不提前訓練小鼠以便獲得客觀數據。a.Y迷宮實驗:Y迷宮由3個不透明手臂呈120°布置,測試時將小鼠放置于迷宮任意一臂末端,并允許其探索任意一個手臂,實驗時間8 min。觀察小鼠進入各臂順序,記錄總進臂次數(小鼠4只腳均進入迷宮臂記為1次)和自發交替次數(依次連續進入全部3個手臂記為1次),計算自發交替行為概率。自發交替行為概率=自發交替次數/(總進臂次數-2)×100%。b.拉力測試:實驗采用YLS13A拉力系統測量小鼠腦損傷對側前肢力量,每只小鼠實驗3次,取平均值進行分析,以便評估小鼠運動能力。c.角落實驗:實驗在2塊紙板形成的30°角落中開展,通過觀察小鼠的活動軌跡,記錄小鼠在20次實驗中右轉的次數,以便評估小鼠記憶能力。右轉率=(右轉次數/20)×100%,以右側胡須接觸角落壁記為小鼠右轉。

7)腦萎縮量化:小鼠完成行為學測試后,取腦組織,采用高精度天平(精確值:0.000 1 g)分別對損傷對側和同側腦組織進行稱重。腦組織損失百分比=損傷同側半腦重量/損傷對側半腦重量×100%[19]。

1.4 統計學方法

以上所有實驗每組至少進行3次,操作人員嚴格遵守雙盲實驗流程。應用GraphPad Prism 8.0軟件處理數據,采用t檢驗或單因素方差分析,使用Tukey/鄧肯檢驗進行2組以上分析。α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 靶點搜索結果

1)藥物靶點搜索結果:搜索Swiss Target Prediction、SEA和pharm Mapper數據庫,共獲得靶點182個,刪除重復項,最終獲得有效藥物靶點176個。

2)疾病靶點搜索結果:搜索Gene Cards、OMIM和DisGeNET數據庫,共獲得靶點2 980個,刪除重復項,最終獲得有效疾病靶點2 173個。

2.2 交集靶點Venn圖

綜合藥物靶點和疾病靶點結果,利用Venny2.1繪制“藥物-疾病”靶點交集Venn圖(圖1),得到交集靶點61個。

圖1 紅景天苷治療缺氧缺血性腦損傷小鼠實驗交集靶點Venn圖

2.3 潛在靶點PPI網絡圖

采用STRING數據庫和Cytoscape 3. 9. 1軟件構建潛在靶點PPI網絡,刪除無相互作用的靶點后剩余有效靶點59個,見圖2。通過拓撲網絡分析篩選出前10位核心靶點,構建核心靶點PPI網絡圖(圖3)。分析顯示,Akt1、IL6、EGFR、HSP90AA1、ESR1、PPARG、SRC、FGF2、KDR、IL2可能為紅景天苷治療HIBD的重要靶點。

PPI為蛋白質相互作用。

PPI為蛋白質相互作用。

2.4 GO功能富集分析結果

GO功能富集結果前10個條目見圖4。BP主要富集到信號傳導、細胞增殖的正調控、凋亡過程的負調控;CC主要富集到細胞溶質、細胞膜、胞外區域;MF主要富集到蛋白質結合、ATP結合、相同蛋白質結合。

圖4 紅景天苷治療缺氧缺血性腦損傷小鼠實驗潛在靶點GO功能富集分析

2.5 KEGG通路富集分析結果

KEGG通路富集分析顯著性居前20位的信號通路氣泡圖見圖5。KEGG通路富集分析結果表明,PI3K-Akt、Rap1、Estrogen等信號通路與紅景天苷-HIBD潛在靶點作用機制緊密聯系。

圖5 紅景天苷治療缺氧缺血性腦損傷小鼠實驗潛在靶點KEGG通路富集分析

2.6 紅景天苷對新生小鼠HIBD誘導腦梗死體積的影響

TTC染色結果示:假手術組小鼠腦組織完整,未見腦梗死區域;缺氧缺血組和安慰劑組小鼠腦組織出現明顯白色梗死區域;紅景天苷組小鼠腦組織梗死區域相比缺氧缺血組和安慰劑組明顯減小。使用Image-Pro Plus 6.0軟件進行定量分析,結果見圖6。與缺氧缺血組和安慰劑組相比,紅景天苷組腦梗死體積顯著縮小(P<0.01),提示紅景天苷治療可有效緩解HIBD誘導的腦梗死。

HIBD為缺氧缺血性腦損傷;與紅景天苷組比較,①P<0.01。

2.7 紅景天苷對新生小鼠HIBD誘導的頂葉皮層神經元和海馬神經元損傷的影響

HE染色結果見圖7,假手術組的頂葉皮層神經元形態完整、排列整齊,層次清晰、形態及數量正常,染色均勻;海馬CA1區神經元排列整齊,可見清晰的海馬結構形態;缺氧缺血組和安慰劑組出現大量空泡,神經元結構萎縮、分布紊亂、排列松散,細胞胞質空泡化,細胞核固縮;紅景天苷組神經元的形態、結構、排列得到明顯改善,空泡減少。結果顯示,紅景天苷治療逆轉了新生小鼠HIBD后腦損傷同側頂葉皮層和海馬CA1區神經元形態損傷。

HIBD為缺氧缺血性腦損傷。

2.8 紅景天苷可激活PI3K/Akt信號通路、減少新生小鼠HIBD誘導的細胞凋亡

Western blot結果及統計分析見圖8。從蛋白條帶看(圖8a),紅景天苷組p-PI3K和p-Akt表達量相較缺氧缺血組和安慰劑組明顯增多,PI3K和Akt表達量明顯減少。從統計結果看(圖8b、8c),與缺氧缺血組和安慰劑組相比,紅景天苷組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相對表達量顯著增加(P<0.05、P<0.01),說明紅景天苷促進了PI3K和Akt的磷酸化,提升了磷酸化的PI3K和Akt占比,激活了PI3K/Akt信號通路。從蛋白條帶看,紅景天苷組抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平較缺氧缺血組和安慰劑組均有升高;紅景天苷組促凋亡蛋白Bax表達水平較假手術組變化不大,但缺氧缺血組和安慰劑組Bax表達水平相較假手術組明顯升高。為衡量Bcl-2和Bax表達的綜合作用,分析二者的相對含量(圖8d),紅景天苷組Bcl-2/Bax表達水平較假手術組、缺氧缺血組和安慰劑組均顯著升高(P<0.01),說明紅景天苷治療使小鼠體內抗凋亡蛋白相較促凋亡蛋白表達更有力。此外,從統計結果看(圖8e),缺氧缺血組和安慰劑組促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3表達水平相較假手術組升高明顯;紅景天苷組Cleaved-caspase-3表達水平相較假手術組升高不明顯。這些結果表明,紅景天苷可以激活PI3K/Akt信號通路、減少新生小鼠HIBD誘導的細胞凋亡。

HIBD為缺氧缺血性腦損傷;8a.Western blot檢測各組新生小鼠PI3K/Akt信號通路相關蛋白和凋亡相關蛋白表達圖;8b～8e.各蛋白表達水平的定量分析;與假手術組比較,①P<0.01;與紅景天苷組比較,②P<0.05,③P<0.01。

2.9 紅景天苷對新生小鼠HIBD誘導的長期神經功能和腦萎縮的影響

Y迷宮實驗結果見圖9a,與假手術組相比,缺氧缺血組和安慰劑組小鼠表現較低的自發交替率;而與缺氧缺血組和安慰劑組相比,紅景天苷組自發交替成功的比率明顯提高(P<0.01)。拉力測試結果見圖9b,與假手術組相比,缺氧缺血組和安慰劑組損傷側對側前肢拉力明顯降低;而與缺氧缺血組和安慰劑組相比,紅景天苷組小鼠損傷側對側前肢拉力顯著增強(P<0.01)。角落實驗結果見圖9c,與假手術組相比,缺氧缺血組和安慰劑組小鼠明顯更傾向于右轉;而與缺氧缺血組相比,紅景天苷組小鼠右轉率明顯降低(P<0.01)。假手術組小鼠的腦組織形態結構完好,而缺氧缺血組和安慰劑組小鼠均出現了不同程度的腦萎縮和腦組織丟失;紅景天苷治療后,腦萎縮情況得到改善。小鼠損傷同側和對側大腦半球的質量比分析見圖9d,與缺氧缺血組和安慰劑組相比,假手術組右腦出現了腦組織缺損;與缺氧缺血組相比,紅景天苷組提高了損傷同側和對側半球的質量比(P<0.01),改善了右腦的組織丟失情況。

HIBD為缺氧缺血性腦損傷;9a～9c為使用Y迷宮實驗、拉力測試、角落實驗評估各組新生小鼠的神經功能;9d采用損傷同側與對側半球的腦重量比評估腦組織丟失程度;與假手術組比較,①P<0.01;與紅景天苷組比較,②P<0.01。

3 討論

新生兒HIBD多是由圍產期窒息所引發的新生兒腦損傷疾病,隨著現代醫療技術的發展,HIBD的神經保護策略、神經康復技術及相關基礎研究均取得了較大進步,但目前針對HIBD尚無確切有效的治療方法。既往研究表明,紅景天苷有多種豐富的藥理作用,已被證實其可通過多個信號通路發揮腦缺血性神經損傷保護作用[20-23],但其對新生兒HIBD的保護機制尚未見報道。為明確紅景天苷對HIBD作用的相關分子機制,本研究通過網絡藥理學方法探索紅景天苷治療新生兒HIBD的可能機制,并在此基礎上進行實驗驗證。

網絡藥理學分析結果表明,紅景天苷作用于HIBD的核心靶點包括Akt1、EGFR和IL6等。GO功能和KEGG通路富集分析顯示,紅景天苷治療HIBD涉及多種生物過程和多個信號通路,主要在調控細胞增殖、抑制細胞凋亡等過程中發揮作用,相關性較高的信號通路包括PI3K/Akt、Rap1和Estrogen等,其中PI3K/Akt通路富集基因較多,同時Akt1是PPI網絡中的顯著靶點,提示紅景天苷可能通過PI3K/Akt通路治療HIBD。

研究表明,PI3K/Akt信號通路是參與調控細胞分化、增殖和凋亡等功能的重要信號通路,可以通過激活PI3K/Akt信號通路,發揮相關神經保護作用[24-28]。PI3K是一種胞內磷脂酰肌醇激酶,PI3K激活后可磷酸化細胞膜表面的二磷酸磷脂肌醇,形成三磷酸磷脂肌醇(PIP3),PIP3通過與Akt的PH結構域結合,促使Akt從細胞質轉位到細胞膜并引發構象改變,進而磷酸化Akt的蘇氨酸和絲氨酸位點使Akt完全活化[29]。Akt作為細胞凋亡的強效抑制因子,對細胞凋亡起著重要調控作用。Akt1是Akt的3種亞型之一,能夠介導調整新陳代謝、細胞存活和血管生成等諸多生物學過程[30-31]?；罨腁kt進一步磷酸化Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3等下游蛋白,從而介導細胞生長、增殖及細胞周期和糖代謝的調控[32]。在新生兒HIBD發病過程中,細胞凋亡起著重要作用[33]。Bcl-2是重要的細胞凋亡抑制基因,而Bax具有促進細胞凋亡作用,Cleaved-caspase-3是凋亡過程主要執行者,在細胞凋亡中發揮關鍵性作用[34-35]。紅景天苷通過抑制細胞凋亡內源性途徑發揮HIBD保護作用[36],它能夠借助上調抗凋亡因子Bcl-2或下調促凋亡因子Bax表達[37],抑制Cytochrome C從線粒體向細胞質釋放,進而下調Cleaved-caspase-3表達,抑制細胞凋亡。PI3K/Akt信號通路和相關蛋白在治療HIBD過程中起重要作用,LI等[38]和陽梅等[39]也分別借助刺囊酸和芍藥內酯苷做出了探索性工作。

本研究驗證了紅景天苷在調節HIBD小鼠腦組織凋亡方面的作用,Western blot實驗結果顯示,紅景天苷可上調HIBD新生小鼠腦組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt的蛋白表達,降低促凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase-3的表達,同時上調抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達,提升Bcl-2/Bax相對表達水平,使得小鼠體內抗凋亡蛋白較促凋亡蛋白表達更明顯。實驗進一步表明,紅景天苷治療可明顯減輕HIBD新生小鼠腦損傷程度,降低腦梗死率,顯著改善小鼠腦損傷,提高小鼠的記憶和運動能力,有助于小鼠運動神經功能障礙和腦萎縮的長期恢復。

綜上,紅景天苷通過激活PI3K/Akt信號通路抑制神經元凋亡,進而對新生小鼠HIBD提供神經保護。本研究提示紅景天苷是治療新生兒HIBD的潛在化合物,為臨床藥物的研發提供了實驗證據和理論依據。

倫理學聲明：本研究遵照了科學可行的實驗方案,并通過了中南民族大學倫理委員會審查批準(2024-scuec-050),符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：文章的全部作者聲明,在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：1)閔加威負責設計論文框架,負責擬定寫作思路,指導撰寫文章并最后定稿;2)陳茹佳負責實驗操作,研究過程的實施,實驗數據收集,統計學分析和圖示繪制,起草并修改論文;3)劉建霞負責藥物和疾病的網絡藥理學分析,網絡藥理學相關方法,圖示和結果編寫和修改。