棉籽大小數量性狀核苷酸定位及候選基因初步篩選

收稿日期：2023-11-07" " " " 第一作者簡介：喬丹，在讀碩士，從事棉花分子育種，qd980807@163.com。*通信作者：陳全家，博士，教授，從事棉花遺傳育種，chqjia@126. com；袁有祿，博士，研究員，從事棉花分子育種，yuanyoulu@caas.cn

基金項目：國家自然科學基金（32070560）；中國農業科學院科技創新工程（CAAS-ASTIP-2016-ICR）；新疆維吾爾自治區自然科學基金（2021D01B114）；新疆維吾爾自治區重大科技專項計劃（2021A02001-

3）；新疆喀什地區科技計劃（KS2023003）；國家現代農業產業技術體系（CARS-15-02）

Quantitative trait nucleotides mapping of cottonseed size-related traits and preliminary

screening of candidate genes

Qiao Dan， Bai Bingnan， Ge Qun， Liu Xiaofang， Luan Yujuan， Niu Hao， Gong Juwu， Gong Wankui， Yan Haoliang， Li Junwen，

Liu Aiying， Shi Yuzhen， Elsamman Elameer， Chen Quanjia*， Yuan Youlu*

摘要：棉籽是陸地棉（Gossypium hirsutum L.）生物產量的重要決定因素之一，棉籽大小影響種子的生長發育，最終影響籽棉產量。為發掘控制棉籽大小的遺傳位點和候選基因，以中國農業科學院棉花研究所培育的陸地棉ZR014121和EZ60為親本構建了200個重組自交系（recombinant inbred line， RIL）的群體，在2年2個地點（河南省安陽縣、河北省威縣）對棉籽粒長、粒寬、籽粒面積、籽粒周長、籽粒圓度和籽指這6個棉籽大小相關性狀進行表型鑒定，結合液相芯片基因分型RIL群體得到的高質量單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism， SNP）數據進行全基因組關聯分析（genome-wide association study， GWAS），挖掘控制相關性狀的數量性狀核苷酸（quantitative trait nucleotide， QTN）位點并篩選候選基因。結果發現：在4個環境下，6個棉籽大小性狀的表型數據均符合正態分布，除籽粒圓度外，其他性狀均呈顯著正相關，且在RIL群體中存在豐富的表型變異，變異系數范圍為3.46%～10.82%。GWAS共檢測到47個與6個棉籽性狀關聯的SNP位點，分布于21條染色體上，其中有8個SNP位點在2個或2個以上環境中能被穩定檢測。通過分析置信區間內基因的功能和轉錄組表達數據，初步推測Gh_D05G1018和Gh_A10G1731為控制棉籽生長發育的候選基因。這些研究結果為棉籽大小相關性狀的遺傳改良奠定基礎。

關鍵詞：陸地棉；棉籽大小；全基因組關聯分析；重組自交系群體；單核苷酸多態性；數量性狀核苷酸；候選基因

棉花（Gossypium hirsutum L.）是重要的經濟作物，是世界上最重要的天然紡織材料來源[1-2]。棉籽是棉花的重要產品之一，是植物油和植物蛋白主要來源之一[3]。棉籽由受精的胚珠發育而成，棉纖維由胚珠表皮細胞發育而成，兩者呈現負相關[4]。當前棉花育種過程中，多注重產量與纖維品質相關性狀的遺傳改良，而忽略了棉籽相關性狀的改良，使得棉花纖維產量和品質不斷提高的同時棉籽卻越來越小，從而影響種子活力[4-5]。前人研究表明，棉花纖維產量性狀與棉籽大小相關性狀間呈負相關，高產品種尤其是高衣分品種的籽指通常較低[6]。近年來，為了提高棉農的綜合植棉效益，育種者在開展棉花纖維改良的同時，也開始對棉籽性狀進行遺傳研究[7-9]。解析棉籽大小相關性狀的遺傳基礎，能夠為棉花纖維與棉籽的同步改良提供理論依據，并為棉花高產、高品質分子標記輔助選擇育種奠定基礎[10]。

關于水稻、小麥、玉米和大豆籽粒相關性狀遺傳位點解析的研究均有報道。其中，對水稻籽粒形狀、大小的研究較為深入，到目前為止，在水稻的12條染色體上已鑒定到500多個與粒重和粒形相關的數量性狀位點（quantitative trait loci， QTL）[11]。宋博文等[12]利用完備區間作圖（inclusive composite interval mapping， ICIM）和復合區間作圖（composite interval mapping， CIM）分別對水稻重組自交系（recombinant inbred lines， RIL）群體的粒長、粒寬、籽粒長寬比、千粒重、籽粒周長和籽粒截面積等性狀進行QTL定位，分別檢測到65個和81個QTL，其中40個QTL可以用上述2種方法同時檢測到。張志輝等[13]利用混合線性模型對包含300份冬小麥的自然群體進行全基因組關聯分析（genome-

wide association study， GWAS），檢測到66個與小麥籽粒大小和形態相關的穩定關聯位點，其中37個一因多效位點與2個及以上籽粒相關性狀顯著關聯，并初步篩選到9個與籽粒大小和形態相關的候選基因。奉杰等[14]利用ICIM法對玉米F2：3群體進行籽粒相關性狀的QTL定位，共鑒定到124個與粒長、粒寬和百粒重相關的QTL，篩選到3個候選基因。目前，關于棉籽大小的遺傳定位研究較少，Wang等[8]利用棉花RIL群體對棉籽籽指、種仁百粒重、種仁長度和種仁寬度等性狀進行QTL定位，分別定位到6個與種仁長度相關的QTL、6個與種仁寬度相關的QTL。柯會峰等[9]利用419份棉花材料構成的自然群體對棉籽粒長、粒寬、籽粒長寬比、籽粒面積和周長等性狀進行GWAS，檢測到30個與棉籽形狀、大小關聯的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism， SNP）位點，并初步推測Gh_D05G0148和Gh_D05G0144為控制棉籽發育的候選基因。

隨著測序技術的快速發展，GWAS已成為挖掘復雜數量性狀遺傳位點的常用方法，GWAS研究無須構建特定的作圖群體，常以變異豐富的自然群體和種質資源為試驗材料，但進行GWAS時須控制由復雜群體結構造成的假陽性。在油菜、小麥和棉花等作物中已有諸多利用RIL群體開展GWAS研究的報道，周會汶等[15]以甘藍型油菜自交系為材料進行GWAS，檢測到209個與硫苷含量顯著關聯的SNP位點；郝倩琳等[16]分別以豆麥/石4185構建的RIL群體和186份品種（系）構成的自然群體為材料進行GWAS，共鑒定到36個穩定關聯位點；Niu等[17]利用中國農業科學院棉花研究所（簡稱為“中棉所”）培育的ZR014121、CCRI60和EZ60為親本，構建2個RIL群體進行GWAS，共鑒定出100個與衣分和鈴重相關的QTL。本研究以中棉所培育的棉花品種ZR014121與EZ60為親本構建的200個RIL為試驗材料，對2年2點共4個環境下的棉籽長度、寬度等性狀進行表型鑒定，利用3V多位點隨機-SNP-效應混合線性模型（3VmrMLM）進行GWAS，鑒定與棉籽形狀、大小相關的數量性狀核苷酸（quantitative trait nucleotide， QTN），并篩選候選基因，為棉籽大小相關性狀的遺傳改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以中棉所培育的衣分較低但纖維品質優的品系ZR014121為母本（以下簡稱為“ZR”）和高衣分早熟品系EZ60為父本雜交構建的200個RIL為材料，將RIL群體命名為EZ60群體。

1.2 研究方法

1.2.1 試驗設計。2020年4月中下旬，將親本ZR、EZ60以及200個F6：8家系種植于中國農業科學院棉花研究所試驗基地（河南省安陽縣）和河北省農林科學院棉花研究所試驗基地（河北省威縣）。2021年4月中下旬，將上述雙親及F6：9家系種植于上述2個試驗基地。根據種植年份及地點，將表型調查環境分別命名為AY20、HB20、AY21和HB21。田間試驗采用不完全隨機區組設計，每份材料種植1行，設2個重復，每20行設1個對照（中棉所60）。行長3.0 m，行距0.8 m，株距0.20～0.25 m。田間管理依據當地農業生產實際進行。

1.2.2 棉籽大小相關性狀測定。待棉花成熟后，人工收獲中部棉鈴30個，經軋花獲得棉籽，選取100粒完整、粒大飽滿的良好棉籽進行籽指測量。經96%～98%（質量分數）濃硫酸脫絨，干燥至質量恒定后，使用BenQ彩色掃描儀（明基智能科技有限公司，上海）進行棉籽形狀大小的檢測，使用SmartGrain軟件進行統計[18]，具體性狀包括棉籽的粒長（seed length， SL）、粒寬（seed width， SW）、籽粒面積（seed area size， SAS）、籽粒周長（seed perimeter length， SPL）、籽粒圓度（seed circularity， SC）和籽指（seed index， SI）。

1.2.3 數據分析。利用SPSS v24軟件對各性狀的表型數據進行基本描述性統計分析，利用Origin軟件繪制各性狀的正態分布圖和相關性圖。

1.2.4 關聯分析與候選基因篩選。結合群體液相芯片基因分型得到的8 348個特異性SNP位點[17]和4個環境下6個棉籽相關性狀的表型數據，利用R語言“IIIVmrMLM”軟件包[19]的3VmrMLM進行棉籽相關性狀的QTN定位，通過LOD（logarithm of the odds）篩選計算閾值，LOD score設置為2[19]。

在顯著關聯位點附近200 kbp范圍內篩選控制棉籽相關性狀的候選基因，候選基因的功能注釋參考TM-1基因組[20]。利用棉花TM-1胚珠不同發育時期的轉錄組數據[基因表達量用FPKM（fragments per kilo base per million mapped reads）值表示，取樣時間包括棉花開花后0、1、3、5、10、20、25和35 d（下載網址為https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/

PRJNA490626/）]，分析上述候選基因在胚珠中的表達水平，并采用TBtools v1.2.0軟件繪制候選基因表達熱圖。

2 結果與分析

2.1 EZ60群體棉籽相關性狀表型變異與相關分析

2.1.1 基本描述性分析。4個環境下6個棉籽大小相關性狀的基本描述性統計結果（表1）表明，除籽指外，雙親的其他5個性狀的最大值均出現在環境AY21；雙親間籽粒圓度差異較??；4個環境下EZ60的籽粒周長均大于親本ZR；EZ60的籽粒面積和粒寬在AY21、AY20、HB21環境下均大于親本ZR；但在HB20環境中，親本EZ60除籽粒周長外的5個性狀均略低于親本ZR。EZ60群體中，籽粒面積、籽粒周長、粒長、粒寬和籽指平均值的最大值均出現在環境AY21，且5個性狀的最大值也均出現在AY21，最小值均出現在HB21，環境間表型變異較大。除籽粒圓度外，其他5個性狀的變異系數范圍為3.46%～10.82%，存在豐富的表型變異；籽粒圓度的變異系數范圍為1.68%～1.94%，說明此性狀表型離散度低，較為穩定。另外，4個環境下6個棉籽大小相關性狀的偏度與峰度絕對值均小于1，數據呈連續正態分布，環境間分布趨勢基本一致（圖1），表明棉籽大小性狀由多個微效基因控制，符合數量性狀的遺傳特點。

2.1.2 相關分析。分別對4個環境下EZ60群體6個棉籽大小性狀間的相關性進行分析，結果（圖2）顯示：籽粒圓度與粒寬呈正相關（但在4個環境下均不顯著），且與籽粒面積、籽粒周長和粒長呈極顯著負相關，與籽指呈負相關（在AY20環境下相關性不顯著，而在其余3個環境下極顯著相關），其余各性狀之間均呈極顯著的正相關。

2.2 EZ60群體棉籽大小相關性狀的QTN

通過GWAS共檢測到47個與6個棉籽大小性狀顯著關聯的SNP位點，分布于21條染色體上（表2）。其中，有8個SNP位點在2個或2個以上環境下被檢測到，分布在A07、A10、D03、D05和D12染色體上，可解釋1.83%～30.00%的表型變異，這些位點受環境影響較小，可穩定遺傳。GWAS定位到14個控制籽粒圓度的SNP位點，但均出現在單環境中，說明該性狀可能受環境影響較大或該RIL群體中不存在控制籽粒圓度的主效位點。A07染色體上共鑒定到6個SNP-性狀關聯位點，分別為A07：70 700 387、A07：71 127 059、A07：71 993 462、A07：72 067 994、A07：72 213 592和A07：73 662 214。除A07：73 662 214外，其他5個位點都至少與2個性狀顯著關聯，在A07染色體上的SNP位點A07：71 993 462與籽粒面積、籽粒周長、粒長和籽指均顯著關聯，解釋12.70%～30.00%的表型變異。

2.3 棉籽大小相關性狀的候選基因篩選

2.3.1 棉花胚珠不同發育時期候選基因綜合分析。以2個或2個以上環境中同時定位到的位點為穩定關聯位點，本研究共定位到8個控制籽棉大小相關性狀的穩定位點（表2）。根據8個穩定位點的物理位置，在其附近200 kbp區間內共鑒定到103個基因，結合TM-1胚珠不同發育時期的表達模式，在胚珠發育全期（開花后0～35 d）以平均FPKM值＞5為標準，進一步篩選到20個高水平表達和差異表達的候選基因（圖3，參見封二彩版）。有7個候選基因（Gh_D05G0987、Gh_D05G1002、Gh_D05G1005、Gh_D05G1007、Gh_D05G1013、Gh_D05G1025、Gh_D12G0392）在胚珠發育前期（開花后1～10 d）具有較高的表達水平，12個基因（Gh_A10G1729、Gh_A07G1732、Gh_A07G1759、Gh_A07G1767、Gh_D05G0982、Gh_D05G0986、Gh_D05G0988、Gh_D05G0989、Gh_D05G1000、Gh_D05G1001、Gh_D05G1017、Gh_D05G1018）在胚珠發育全期均高水平表達，1個基因（Gh_A07G1731）在胚珠發育后期（開花后20～35 d）具有較高的表達水平。

2.3.2 候選基因篩選。結合TM-1參考基因組的基因功能注釋，對上述胚珠不同發育時期高表達及差異表達基因進行分析，結果（表3）顯示，A10染色體上的Gh_A10G1731基因功能注釋為乙烯響應轉錄因子WRI1（Wrinkled 1）。WRI1是AP2/

EREBP類轉錄因子的成員，在擬南芥中首次被發現并命名[21]，與種子的萌發和幼苗的形態建成有關[22]。分析Gh_A10G1731在TM-1棉花胚珠不同發育時期的表達量發現，該基因在胚珠發育前期（開花后1～10 d）表達量較低，在開花后20 d的胚珠中表達量大幅增加，且在胚珠發育后期一直保持相對高水平的表達，與胚珠發育前期表達量相比，增加約8.5倍，預測該基因可能與棉籽生長發育有關。除此之外，D05染色體上的Gh_

D05G1018基因功能注釋為蛋白質網絡4A（Networked 4A， NET4A）。NET4A屬于植物特異性網絡（NET）家族。NET家族被鑒定為與膜相關的肌動蛋白結合蛋白[23]，與調節細胞大小有關[24]。

Gh_D05G1018在棉花胚珠發育全期（開花后0～35 d）均高表達，在開花后10 d和35 d時的表達量達到最高，推測其可能在棉花種子生長發育階段發揮作用。

3 討論

棉花品種的纖維產量與棉籽大小存在一定的相關性，棉籽變小會直接影響種子的活力，從而限制棉花纖維產量的進一步提高[5]。EZ60群體中，除籽粒圓度外，其他5個性狀在4個環境下的平均值的最大值均出現在AY21，且5個性狀的最大值也均出現在AY21，最小值均出現在HB21，環境間表型變異較大（表1）。AY21環境下棉籽大小相關的6個性狀表型數據普遍較高，通過查閱氣象資料發現：環境AY20、AY21、HB20和HB21在7－9月的總降水量分別為8.41 mm、134.26 mm、18.28 mm和26.75 mm（數據來源于https：//www.ncei.noaa.gov/maps/daily/），推測可能是由于在棉花生長關鍵時期（7－9月），AY21環境的降水量過高，導致生長過程中部分棉鈴脫落，留存下來的棉鈴成熟度更好，棉籽更大。

本研究中，棉花RIL群體籽粒圓度與粒寬呈現不顯著正相關，與籽指呈現負相關（AY20環境相關性不顯著，其余3個環境下顯著相關），與其他3個性狀呈顯著負相關，籽粒面積、周長、粒長、粒寬和籽指間均呈極顯著正相關。Wang等[8]對RIL群體的棉籽籽指、種仁百粒質量、種仁寬度和種仁長度這4個性狀在3個環境下開展表型鑒定，結果顯示，除種仁長度外各性狀均存在顯著相關關系。柯會峰等[9]對自然群體的粒長、粒寬、籽粒長寬比、籽粒面積和周長進行表型測定，結果也顯示棉籽性狀間存在顯著相關性，與本研究結果一致。

同時，本研究利用GWAS共鑒定到與棉籽大小相關的QTN位點（SNP）47個，其中8個與籽粒面積顯著關聯，13個與籽粒周長顯著關聯，9個與粒長顯著關聯，11個與粒寬顯著關聯，9個與籽指顯著關聯，14個與籽粒圓度顯著關聯。另外，13個QTN位點是一因多效的。與前人研究結果相比，本研究定位到的棉籽大小相關位點所在染色體與先前報道相同的有A02、A04、A05、A06、A07、A08、A09、A11、A12、A13、D01、D03、D05、D07、D09、D10、D11、D12[25-30]，這表明本研究關聯分析的結果可靠。本研究在A03和D13染色體上定位到控制棉籽大小的新位點，為棉籽育種提供新的位點信息。本研究在A07染色體上共檢測到20個控制棉籽大小的SNP-性狀關聯位點，共定位于6個SNP位點，其中5個位點至少與2個性狀相關聯，推測A07染色體上存在一因多效性基因，影響棉籽的多個性狀。李蓓等[28]采用混合群體分離分析技術，在A07染色體（42.6 Mbp～91.6 Mbp）上鑒定到與籽指相關的QTL；柯會峰等[9]在A07染色體上定位到A07：70 700 642和A07：72 096 450與棉籽籽粒面積、籽粒周長和粒長顯著關聯，與本研究在A07染色體A07：70 700 387和A07：72 067 994位置上定位到的棉籽大小顯著關聯SNP分別相距255 bp和28 456 bp，距離較近。因此，進一步證實該區段可能為影響棉籽大小的重要區段。

本研究在定位到的穩定關聯位點上下200 kbp的區間篩選到多個與棉籽大小相關的候選基因，其中A10染色體上的Gh_A10G1731基因在開花后20 d及胚珠發育后期優勢表達，功能注釋為乙烯響應轉錄因子WRI1，在過表達WRI1基因的擬南芥的培養基中添加2-脫氧葡萄糖，種子萌發受抑制的作用較小，表明WRI1與種子的萌發和幼苗的建成有關[22]。目前，WRI1轉錄因子在擬南芥、亞麻薺、玉米、小麥和棉花等作物中已有報道[31-35]，其在植物油脂合成與積累方面具有重要意義[34]。Zhao等[35]研究發現，過表達GhWRI1可增加轉基因擬南芥的種子含油量和種子質量，GhWRI1可能調控棉籽中的油脂積累。除此之外，D05染色體上的Gh_D05G1018基因在棉花胚珠發育全期（0～35 d）均較高水平表達，在開花后35 d時表達量達到最高，推測其可能在棉籽生長發育階段發揮作用。該基因功能注釋為NET4A，NET4A被定位在液泡膜高度收縮區域，與液泡形態有關[36]。Kaiser等[37]發現，與野生型擬南芥相比，過表達該基因的擬南芥的液泡更小、更接近球形、更緊湊，對生長素的敏感性降低。在擬南芥的根中，生長素介導的液泡尺寸決定了細胞伸長率，從而影響細胞大小，所以前人推測NET4A參與液泡-細胞骨架網絡的調節[37]。后續將通過棉花基因編輯和過表達技術驗證候選基因的功能，從而為棉籽性狀相關研究提供重要的基因資源。

4 結論

本研究以200個RIL的群體為試驗材料，對2年2點4個環境下的棉籽大小相關性狀進行GWAS，共檢測到47個與6個棉籽大小性狀顯著關聯的QTN，分布于21條染色體上。有8個QTN位點在2個或2個以上環境中能夠被穩定檢測，A07染色體上A07：71 993 462、A07：72 067 994和A07：72 213 592位點距離較近，且與多個環境下的棉籽大小性狀相關聯，推測A07染色體上的基因組區段（71.99 Mbp～72.22 Mbp）可能包含控制棉籽大小性狀的重要基因。結合TM-1的基因功能注釋及胚珠不同發育時期的轉錄組數據，在顯著關聯SNP位點附近篩選到候選基因Gh_A10G1731和Gh_D05G1018，推測其與棉籽生長發育相關。該研究結果為棉花棉籽大小相關性狀的遺傳改良奠定了基礎。

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（責任編輯：莊蕾" " 責任校對：楊子山）

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