橋本甲狀腺炎伴甲狀腺腫患者的腸道菌群特征研究

孟淑華 肖瑤 高云逸 魏軍平

橋本甲狀腺炎(hashimoto’s thyroiditis,HT)是一種臨床上常見的自身免疫性甲狀腺疾病,也是目前導致甲狀腺功減退的主要原因[1]。我國HT的患病率為1.6%,發病率為0.69%,且近年來HT的發病率也逐漸升高[2]。該病臨床特征主要包括甲狀腺體積增大、淋巴細胞浸潤以及甲狀腺自身抗體水平升高。HT又分為甲狀腺腫型和萎縮型,然而,HT以及造成兩種不同類型的發病機制尚未完全明確,目前臨床上針對HT的治療也主要以改善甲狀腺功能、調節免疫為主,針對甲狀腺腫尚無特殊治療方式。因此,需要從新的角度探討HT及HT相關甲狀腺腫的發生發展機制,以助開發新的治療用藥。 腸道菌群對人體健康存在影響已被廣泛認可。近年來,隨著16S rRNA測序技術的發展,腸道菌群與自身免疫性疾病以及內分泌代謝相關疾病的研究成為熱點。研究表明,HT患者腸道菌群的豐度及多樣性與健康人有明顯差異,因此腸道菌群物種組成和豐度改變可能與HT發病相關[3-5]。同時,從組織胚胎學角度看,甲狀腺是由原始消化管的前腸分化而來,腸道菌群的改變可能對甲狀腺組織的形態、大小也存在一定的影響。然而,關于甲狀腺腫與腸道菌群之間的關系尚不明確。因此,本研究采用16S rRNA測序技術對HT伴甲狀腺腫患者、HT不伴甲狀腺腫患者和健康人群進行腸道菌群檢測,以觀察HT及HT伴甲狀腺腫患者的腸道菌群豐度、多樣性等特征。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年10月至2021年12月于北京市西城區廣外醫院、中國中醫科學院廣安門醫院招募的健康受試者(A組,n=10)、HT伴甲狀腺腫患者(B組,n=9)、HT不伴甲狀腺腫患者(C組,n=12)。

1.2 診斷標準

1.2.1 HT診斷標準:參考2008年中華醫學會內分泌學分會發布的《中國甲狀腺疾病診治指南-甲狀腺炎》[6]中HT的診斷標準。

1.2.2 甲狀腺腫判斷標準:甲狀腺腫的判斷以臨床醫生的望診及觸診為主,其判斷標準參見《診斷學》[7]:①甲狀腺Ⅰ度腫大:外觀上看不出,但觸診可以觸及甲狀腺;②甲狀腺Ⅱ度腫大:既可以看到又可以觸及甲狀腺腫大,但腫大范圍在胸鎖乳突肌以內;③甲狀腺Ⅲ 度腫大:腫大程度超過胸鎖乳突肌外側緣。

1.3 納入標準

1.3.1 納入橋本甲狀腺炎伴甲狀腺腫組、不伴甲狀腺腫組的標準:①符合橋本甲狀腺炎診斷標準;②近3個月內未服用硒酵母片(或膠囊)等硒制劑;③近3個月內未患有感染性疾病或服用抗生素類藥物;④近3個月內未服用任何中藥(包括中成藥、成分明確的湯劑以及成分未知的偏方等);⑤近3個月內未服用過益生菌/益生元或其他微生態調節劑;⑥近3個月內未曾患過包括急性胃腸炎在內的任何腸道相關疾病;⑦年齡18～65歲;納入患者需符合以上全部條件,任何一項為“否”,此受試者不能參加試驗。

1.3.2 納入健康受試組的標準:①無橋本病或甲狀腺疾病及相關家族病史;②近3個月內未患有感染性疾病或服用抗生素類藥物;③近3個月內未服用任何中藥(包括中成藥、成分明確的湯劑以及成分未知的偏方等);④近3個月內未服用過益生菌/益生元或其他微生態調節劑;⑤近3個月內未曾患過包括急性胃腸炎在內的任何腸道相關疾病;⑥年齡18～65歲。納入人群需符合以上全部條件,任何一項為“否”,此受試者不能參加試驗。

1.4 排除標準 (1)合并有感染性疾病、惡性腫瘤、冠心病、高血壓、糖尿病、腦血管疾病、白血病、急性心力衰竭、急性冠脈綜合征等嚴重基礎疾病者;(2)妊娠期或哺乳期女性;(3)具有精神性疾病患者及不能配合完成試驗期間實驗室檢查及問卷調查者。如以上任何一項為“是”,此受試者不能參加試驗。

1.5 調查內容 (1)一般資料:包括受試者的性別、年齡、身高、體重、體重指數(BMI)、血壓、心率等;(2)甲狀腺功能及自身抗體水平:甲狀腺功能包括:促甲狀腺激素(TSH)、游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、總三碘甲狀腺原氨酸(TT3)、總甲狀腺素(TT4);甲狀腺自身抗體包括:甲狀腺過氧化物酶抗體(TPO-Ab)和甲狀腺球蛋白抗體(Tg-Ab);(3)甲狀腺超聲檢查;(4)甲狀腺查體:包括甲狀腺的質地、大小、是否觸及結節及是否存在觸痛等;(5)臨床癥狀及中醫基本證型:基本證型根據受試者臨床癥狀及舌脈進行判定,分為陰證及陽證兩大證型。

1.6 16S rRNA基因測序檢測

1.6.1 糞便樣本采集與保存:準備糞便樣本收集套裝(包括一次性采樣拭子、穩定劑、防震袋、采樣紙、一次性手套)交于受試者。告知受試者先排空尿液,戴上一次性手套取中層未被污染(未直接接觸空氣及便池)的新鮮糞便樣本約2 g置于試管中,囑受試者采集后立即交研究人員。待取得受試者的新鮮糞便樣本后,立刻放入-80℃冰箱保存待行后續16S rRNA檢測。

1.6.2 生物信息數據提取流程:①常規方法提取糞便樣本中的總DNA;②針對V3與V4測序區域合成引物,進行PCR擴增;③將擴增后的PCR產物純化并進行二次擴增,引入所需的接頭序列,構建16S擴增子文庫,并進行文庫的純化和質檢;④運用Illumina MiSeq平臺將質量良好的產物上機測序,得到原始數據。

1.6.3 生物信息數據分析流程:將高通量平臺測序后得到的原始數據去雜處理后進行拼接,得到可用的優質序列數據,將相似度高于97%的序列聚類為1個操作分類單元(OTU),之后與相關的數據庫比對并進行物種注釋。基于OTU豐度進行Alpha多樣性分析及Beta多樣性分析,結果關聯后得出腸道菌群的物種豐度及群落結構。Alpha多樣性是指一個特定區域或生態系統內的多樣性,使用mothur[9]計算Alpha多樣性指數,以反映樣本中微生物的豐富度和均勻度。其中,Chao1指數和ACE指數反映物種的豐富度,分別是使用Chao1和ACE方法估計所得樣品中實際存在的物種數,數值越大說明物種越豐富;shannon為香農指數,評價物種數和各種間個體分配的均勻性兩部分,其數值越大,說明樣品多樣性越高,個體分配越均勻;simpson為辛普森指數,是指隨機抽取的兩個個體屬于不同種的概率,其數值越小,表明物種多樣性越高。

2 結果

2.1 3組受試者一般情況比較 3 組受試者的年齡、性別比、身高、體重、BMI、血壓(收縮壓、舒張壓)、心率等一般情況比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組受試者一般情況比較

2.2 HT受試者甲狀腺功能、自身抗體水平及甲狀腺結節伴隨情況比較 依據檢驗結果參考值范圍為標準將HT受試者分為甲功正常期、亞臨床甲減期與甲減期;根據TPO-Ab及Tg-Ab>1 000 U/mL作為抗體高滴度的評判標準;根據甲狀腺超聲是否檢測出甲狀腺結節作為是否伴有甲狀腺結節的評判標準。B組與C組間在甲功分期、甲狀腺滴度、是否伴有甲狀腺結節等方面差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 HT受試者甲狀腺功能、抗體及超聲情況比較 例(%)

2.3 腸道菌群分析結果

2.3.1 腸道菌群測序結果及OTU聚類分析:本研究共納入31個樣本,共得到4 238 310個原始序列;將原始序列進行拼接及過濾后,共得到1 437 030個序列。使用 USEARCH[8]將序列相似度>97%的序列聚類為1個OTU,OTU 聚類時將稀有序列棄去,最終共聚類為16 941個OTU,以OTU為基礎進行多樣性分析。由于每組均有多個樣本,若檢測到某個OTU樣本數達到該組樣本數量的50%以上,認為這組含有這個OUT。B組腸道菌群樣品平均OTU;A組腸道菌群OTU(622.5±176.8)個相較于B組(544.2±194.4)個及C組(484.8±243.3)個更多,但OTU數目總體數差異無統計學意義(P=0.324)。此外,分析3組共有和特有的OTU發現,3組共有的OTU有120個,A組、B組、C組特有的OTU分別為123個、75個、15個。 見表3。

表3 3組OTU數量比較 個,

2.3.2 Alpha多樣性比較:檢測3組樣本覆蓋率均>0.99,表明樣本中序列被檢出的概率均很高。A組菌群的豐富度及均勻度較B組和C組更高,而C組的菌群多樣性較B組更低,但差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 3組受試者腸道菌群Alpha多樣性指數

2.3.3 Beta多樣性比較:Beta多樣性反映的是不同樣本間的微生物群落構成差異情況。本研究采用Unifrac生成群落間距離矩陣,計算不同樣本間的差異。UniFrac度量方法又分為weighted UniFrac和unweighted UniFrac,其中unweighted UniFrac只考慮 OTU 組成,不考慮其豐度;weighted UniFrac則需考慮其豐度。unweighted UniFrac的聚類熱圖分析,熱圖以顏色代表群落距離,距離越小(越紅)群落相似度越高,距離取值為[0, 1]。在不考慮OTU豐度的情況下,健康受試者的腸道菌群樣本間差異更小,而HT患者(不論是否伴有甲狀腺腫)樣本間差異相對更大,但3組間差異不明顯。weighted UniFrac的PCoA三維分析,坐標軸為 PcoA 降維后產生的新變量,括號內百分比為新變量的解釋量。在考慮OTU豐度的情況下,3組間樣本可呈現相互分離的趨勢,且橋本伴甲狀腺腫組間不同樣本分布更離散,相似性更小。見圖1、2。

圖1 unweighted UniFrac距離熱圖;A 健康受試者;B 橋本伴甲狀腺腫者;C 橋本不伴甲狀腺腫者

圖2 weighted UniFrac的 PcoA三維圖;A 健康受試者;B 橋本伴甲狀腺腫者;C 橋本不伴甲狀腺腫者

2.3.4 物種分布及其豐度的比較:為探討3組腸道菌群的分布特征,尋找組間在科、屬水平的差異物種,行Kruskal-Wallis檢驗,找出差異顯著的菌科和菌屬。

2.3.4.1 在科水平上:B組患者的擬桿菌科(Bacteroidaceae)顯著低于A組和C組,而普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)及韋榮氏球菌科(Veillonellaceae)則顯著高于A組和C組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 3組腸道菌群科水平相對豐度水平(前10位) M(P25,P75)

2.3.4.2 在屬水平上:B組患者的擬桿菌屬(Bacteroides)顯著低于A組和C組,差異有統計學意義(P<0.05),而B組的普氏菌屬(Prevotella)顯著高于A組和C組,差異有統計學意義(P<0.05)。此外,HT患者的羅氏菌屬(Roseburia)和布勞特氏菌屬(Blautia)相對豐度較A組低,且B組較橋C組更低,但3組間Roseburia和Blautia比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表6。

表6 3組腸道菌群屬水平相對豐度水平(前10位) M(P25,P75)

3 討論

人體內的腸道菌群種類豐富,數量龐大,其復雜性與多樣性是人類和微生物共同進化的結果,對人體健康有許多直接或間接的影響。隨著近年來腸道菌群與甲狀腺疾病研究的深入,證據表明可能存在一個甲狀腺-腸軸使腸道菌群參與各種甲狀腺疾病的發生發展之中[10]。本研究發現,從整體微生物群落構成角度來看，健康受試者腸道菌群的豐富度及均勻度較HT受試者更高,且HT伴甲狀腺腫與HT不伴甲狀腺腫2組間也具有菌群分布差異,說明HT患者腸道菌群的改變與是否伴有甲狀腺腫有一定關系。此外,本研究從科、屬水平對3組間的菌群豐度進行了非參數秩和檢驗,發現HT伴甲狀腺腫組擬桿菌科及菌屬的豐度顯著低于其他2組,而普雷沃氏菌科、韋榮氏球菌科及普氏菌屬的豐度則顯著高于另外2組,說明這些菌科及菌屬可能是區別HT是否伴有甲狀腺腫的生物標志物。但由于是否伴有甲狀腺腫是以臨床醫生查體作為判斷標準,臨床查體手法的差異可能在區別無甲狀腺腫及Ⅰ度甲狀腺腫時存在一定誤差,可能對HT伴甲狀腺腫組和HT不伴甲狀腺腫組腸道菌群差異性分析造成一些影響。

HT分為甲狀腺腫型和萎縮型。有研究認為,HT引起甲狀腺腫的原因可能與細胞及抗體介導的甲狀腺組織破壞、甲狀腺功能受損,反饋性刺激腺體分泌TSH,進而刺激甲狀腺細胞腫大有關,故甲狀腺體積大小在一定程度上可能也反映了甲狀腺局部免疫反應的情況[11]。此外,HT患者甲狀腺體積/質量大小與甲狀腺功能[12-13]、淋巴細胞浸潤與局部水腫[14]、甲狀腺細胞增殖與細胞凋亡關系的失衡[15]、血清TSH水平[16]和碘水平[17]等具有一定關系。腸道菌群對T細胞亞群介導的免疫調節、碘的吸收、細胞凋亡等方面都具有影響。擬桿菌屬主要與免疫調節、碘吸收等方面相關。研究表明,脆弱擬桿菌的莢膜多糖可以刺激IL-10等免疫抑制因子的產生,并誘導激活其向Tregs轉化[18],而Th17 /Treg細胞失衡與HT的發生密切相關;多形擬桿菌及其代謝產物也可通過減少與腸上皮細胞表面Toll樣受體結合,抑制NF-κB活性,下調IL-6、IL-1β、TNF-α等下游炎性因子的表達,進而抑制局部免疫反應的發生[19]。此外,人體內有一種Na+/多種維生素轉運蛋白,可以代表腸吸收碘的互補結構,若腸道菌群出現紊亂、腸黏膜屏障受損,則可能影響碘的吸收[20];而擬桿菌屬可以促進短鏈脂肪酸的生成,進而保護腸黏膜屏障[21],對碘的吸收產生影響。本研究中,HT伴甲狀腺腫患者擬桿菌屬水平明顯較其余2組降低,因此可能由于免疫調節或腸道黏膜屏障保護作用的減弱,造成甲狀腺局部免疫反應增強及碘吸收減少,出現甲狀腺腫明顯的表現。同時,韋榮氏球菌科與普氏菌屬則可能通過抑制細胞凋亡對HT及甲狀腺腫產生影響。HT患者的甲狀腺濾泡上皮細胞具有細胞凋亡現象,而一項針對HT患者甲狀腺體積和全基因組的關聯發現,AATF和SMARCA2這兩個與細胞凋亡相關的基因與HT患者的甲狀腺體積顯著相關[22]。Ebersole等[23]發現,韋榮氏球菌科、普雷沃氏菌屬與抗細胞凋亡相關蛋白如AKT3、PI3KCG、CSF2RB、PIK3CD、CFLAR等呈正相關作用。也有研究顯示,進行益生菌、藥物、灸法等干預前后,小鼠胰腺細胞[24]、肝細胞[25]和胃癌細胞[26]的凋亡情況與普雷沃氏菌的變化呈負相關關系,間接說明了普雷沃氏菌與細胞凋亡之間可能存在的聯系。體外研究也表明,韋榮氏球菌科可能通過分泌GroEL蛋白激活CRC細胞的PI3K/AKT通路,從而抑制細胞凋亡[27]。本研究中,普雷沃氏菌、韋榮氏球菌在HT伴甲狀腺腫組豐度較高,可能與這兩種菌對細胞凋亡的抑制性影響相關。

綜上綜述,HT伴甲狀腺腫患者的常見擬桿菌屬等的豐度較HT不伴甲狀腺腫者和健康受試者降低,而普雷沃氏菌科、韋榮氏球菌科及普氏菌屬等豐度則較高。考慮到年齡[28]、性別[29]等因素對腸道菌群會產生影響,因此本研究根據納入HT患者的基本情況對符合納排標準的健康受試者進行匹配以減少偏倚。