白頭翁皂苷 D 通過調控 circ_0001178/miR-885-5p 對甲狀腺癌細胞的生物學行為的影響

潘巧虹 周影 顏衛文 李莉 孫雯 陶桂蘭 肖歡

甲狀腺癌是臨床常見的一種惡性腫瘤,銀杏葉等天然植物的提取物具有清除氧自由基與抗甲狀腺癌等作用,其作用途徑主要涉及多個基因或信號通路[1-4]。白頭翁皂苷 D 屬于毛茛科植物白頭翁的主要活性成分,其具有抗腫瘤作用,并可抑制乳腺癌細胞增殖[5]。但白頭翁皂苷 D 與甲狀腺癌的相關研究相對較少。環狀 RNA(circular RNA,circRNA)是一類閉合的非編碼RNA分子并可能參與多種疾病發生發展過程。研究顯示,circ_0001178 在結直腸癌中表達上調,并可充當多個 miRNA 的海綿分子而促進結直腸癌細胞遷移及侵襲[6]。生物信息學預測顯示circ_0001178 與 miR-885-5p 存在結合位點,研究表明 miR-885-5p 在甲狀腺癌中表達水平降低,circ_0004458 可通過抑制 miR-885-5p 表達而促進甲狀腺癌的發展[7]。但circ_0001178/miR-885-5p 是否參與甲狀腺癌形成及發展過程,是否可作為白頭翁皂苷 D 治療甲狀腺癌的潛在靶點尚未可知。因此,本研究主要探討白頭翁皂苷 D 是否可通過調控 circ_0001178/miR-885-5p 分子軸而影響甲狀腺癌細胞的惡性生物學行為。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 白頭翁皂苷 D(純度≥98%)購自南京春秋生物工程有限公司;人甲狀腺癌細胞 SW579 購自上海通蔚生物;DMEM 培養液與胎牛血清購自美國 Gibco;Trizol 試劑購自北京全式金生物;逆轉錄試劑與熒光定量 PCR 試劑購自北京天根生化;Lipofectamine2000、MTT、Transwell 小室、Matrigel 基質膠購自北京索萊寶;si-NC、si-circ_0001178、miR-NC、miR-885-5p mimics、anti-miR-885-5p 購自廣州銳博生物;pcDNA3.1 與pcDNA-circ_0001178 購自美國Invitrogen;兔抗人 E-cadherin、N-cadherin 抗體與 HRP 標記的山羊抗兔 IgG 二抗購自美國 Santa Cruz。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組:白頭翁皂苷 D 溶解于 DMSO(體積分數<0.1%)中,儲存濃度為 100 nmol/mL,根據需求用培養基稀釋成所需濃度(20、50、100 nmol/mL)[8],SW579 細胞按照每孔 1×104個細胞的密度接種于 24 孔板,分別加入含有不同濃度的白頭翁皂苷 D 培養 24 h,分別記為白頭翁皂苷 D-L 組、白頭翁皂苷 D-M 組、白頭翁皂苷 D-H 組。將未經處理的SW579 細胞正常培養記為對照組。用脂質體轉染技術分別將 si-NC、si-circ_0001178、miR-NC、miR-885-5p mimics 轉染至 SW579 細胞中,分別記為 si-NC 組、si-circ_0001178 組、miR-NC 組、miR-885-5p 組。用脂質體轉染技術分別將 pcDNA-circ_0001178、anti-miR-885-5p 轉染至 SW579 細胞后加入含有濃度為 100 nmol/mL 白頭翁皂苷 D 的培養液培養 24 h,分別記為白頭翁皂苷 D+pcDNA-circ_0001178 組、白頭翁皂苷 D+anti-miR-885-5p 組。

1.2.2 qRT-PCR 檢測 circ_0001178、miR-885-5p 的表達水平:用 Trizol 試劑提取 SW579 細胞總 RNA,RNA 定量后將 RNA 逆轉錄合成 cDNA,以 cDNA 為模板進行PCR 擴增,按照熒光定量 PCR 試劑盒說明書檢測 circ_0001178、miR-885-5p 相對表達量。

1.2.3 MTT 檢測細胞增殖:取各組 SW579 細胞按照每孔 3 000 個細胞的密度接種于 96 孔板,每孔分別加入 20 μL MTT 溶液,于培養箱內繼續培養 4 h 后棄培養液,每孔加入 150 μL DMSO 溶液,室溫孵育 10 min 后酶標儀檢測 490 nm 波長處的吸光度值(OD 值)。

1.2.4 平板克隆形成實驗:取各組 SW579 細胞按照每孔 1 000 個細胞的密度接種于 6 孔板,于培養箱內培養 14 d,直至出現細胞克隆,用 4%多聚甲醛固定 20 min,用 0.1%結晶紫染色液染色 15 min,統計細胞克隆形成數。

1.2.5 Transwell 實驗檢測細胞遷移與侵襲:用不含血清的培養液培養各組 SW579 細胞 12 h,遷移實驗:在小室的上室與下室分別加入200 μL SW579 細胞懸液和 600 μL 含有 10%胎牛血清的培養液,24 h 后用多聚甲醛固定細胞后再用結晶紫染色液染色 15 min,于顯微鏡下觀察并計數。侵襲實驗:將 Matrigel 基質膠稀釋液加入小室的上室(40 μL/孔),待其凝固,后續實驗同遷移實驗。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測circ_0001178 與 miR-885-5p 的靶向結合位點:將 circ_0001178 與 miR-885-5p 的結合序列及其突變序列克隆至 psi-CHECK 載體熒光素酶報告基因載體中,分別構建野生型載體 WT-circ_0001178 與突變型載體 MUT-circ_0001178,將 SW579 細胞按照每孔 1×105個細胞的密度接種于 6 孔板,常規培養 24 h 后,待細胞融合度達到70%時用脂質體轉染技術分別將 WT-circ_0001178、MUT-circ_0001178 分別與 miR-NC、miR-885-5p mimics 共轉染至 SW579 細胞中,轉染 48 h 后收集細胞并按照熒光素酶檢測試劑盒說明書檢測其熒光素酶活性。

1.2.7 Western blot 檢測 E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達:用蛋白裂解液提取各組 SW579 細胞總蛋白,SDS-PAGE 電泳分離蛋白,反應結束后將蛋白樣品轉移至 PVDF 膜上,用封閉液封閉 PVDF 膜 1 h,加入 E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)、GAPDH(1∶3 000)一抗 4℃ 孵育 24 h,加入二抗(1∶5 000)室溫孵育 2 h,曝光顯影后ImageJ 軟件分析蛋白條帶灰度值。

2 結果

2.1 白頭翁皂苷 D 對 SW579 增殖的影響 與對照組比較,白頭翁皂苷 D-L 組、白頭翁皂苷 D-M 組、白頭翁皂苷 D-H 組circ_0001178 的表達量降低(P<0.05),miR-885-5p 的表達量升高(P<0.05),細胞活力降低(P<0.05),克隆形成數減少(P<0.05),且不同劑量組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 白頭翁皂苷D 抑制 SW579 增殖 n=3,

表2 白頭翁皂苷D 抑制 SW57 遷移、侵襲 n=3,

2.2 白頭翁皂苷 D 對 SW579 遷移、侵襲的影響 與對照組比較,白頭翁皂苷 D-L 組、白頭翁皂苷 D-M 組、白頭翁皂苷 D-H 組遷移及侵襲細胞數減少,差異有統計學意義(P<0.05),白頭翁皂苷 D 抑制N-cadherin表達而促進E-cadherin 表達(P<0.05),且呈劑量依賴性。見圖1,表 2。

圖1 白頭翁皂苷 D 對 SW579 遷移、侵襲及 E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達的影響;1 對照組;2 白頭翁皂苷D-L組;3 白頭翁皂苷D-M組;4 白頭翁皂苷 D-H組

2.3 干擾 circ_0001178 對 SW579 增殖、遷移、侵襲的影響 與 si-NC 組比較,si-circ_0001178 組 miR-885-5p 的表達量升高(P<0.05),細胞活力降低(P<0.05),克隆形成數、遷移及侵襲細胞數減少(P<0.05),N-cadherin 蛋白水平降低(P<0.05),E-cadherin 蛋白水平升高(P<0.05)。見圖2,表3。

圖2 干擾circ_0001178 對 SW579 細胞活性遷移侵襲及E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達的影響;1 si-NC;2 si-circ_0001170

表3 干擾circ_0001178 抑制 SW579 增殖、遷移、侵襲 n=3,

表4 miR-885-5p 抑制 SW579 增殖、遷移、侵襲 n=3,

2.4 miR-885-5p 對 SW579 增殖、遷移、侵襲的影響 與 miR-NC 組比較,miR-885-5p 組細胞活力降低(P<0.05),克隆形成數、遷移及侵襲細胞數減少(P<0.05),N-cadherin 蛋白水平降低(P<0.05),E-cadherin 蛋白水平升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3,表 4。

圖3 miR-885-5p 對 SW579 細胞活性遷移侵襲及E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達的影響;1 miR-NC;2 miR-885-5p

2.5 circ_0001178 靶向 miR-885-5p circ_0001178 與 miR-885-5p 存在靶向結合位點。轉染 miR-885-5p mimics 可明顯降低野生型 WT-circ_0001178 的熒光素酶活性(P<0.05),而未能抑制 MUT-circ_0001178 的熒光素酶活性。見圖4,表5。

圖4 circ_0001178 和 miR-885-5p 的互補序

表5 雙熒光素酶報告實驗 n=3,

表6 過表達 circ_0001178 或抑制 miR-885-5p 可逆轉白頭翁皂苷 D 對 SW579 的抑制作用 n=3,

2.6 過表達 circ_0001178 或抑制 miR-885-5p 對白頭翁皂苷 D 處理的 SW579 增殖、遷移、侵襲的影響 與白頭翁皂苷 D 組比較,白頭翁皂苷 D+pcDNA-circ_0001178 組、白頭翁皂苷 D+anti-miR- 885-5p 組細胞活力升高(P<0.05),克隆形成數、遷移及侵襲細胞數增多(P<0.05),N-cadherin 蛋白水平升高(P<0.05),E-cadherin 蛋白水平降低(P<0.05)。見圖5,表 6。

圖5 過表達 circ_0001178 或抑制 miR-885-5p 對白頭翁皂苷D 處理的 SW579 遷移侵襲及E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達的影響;1 對照組;2 白頭翁皂苷D組;3 白頭翁皂苷 D+pcDNA-circ_0001178組;4 白頭翁皂苷D+anti-miR-885- 5p組

3 討論

甲狀腺癌屬于內分泌惡性腫瘤,目前甲狀腺癌的發病機制尚未闡明,因而深入探究甲狀腺癌的發病機制對研發新型的治療藥物成為重點研究,既往研究顯示中醫藥可用于治療甲狀腺癌,其具有副作用小且效果好等優點,但其對甲狀腺癌細胞生物學行為的影響及其可能作用機制尚需進一步探究[9]。circRNA 在甲狀腺癌中表達異常,通過干擾或上調 circRNA 表達可能抑制甲狀腺癌細胞增殖及轉移等惡性生物學行為[10]。但 circRNA 是否可作為中醫藥治療甲狀腺癌的潛在靶點尚未闡明。

白頭翁皂苷 D 可促進肺腺癌細胞凋亡而抑制肺腺癌發展[11]。白頭翁皂苷 D 具有抗腦膠質瘤的作用,其可抑制腦膠質瘤細胞增殖及促進細胞凋亡[12]。白頭翁皂苷 D 等白頭翁皂苷的主要有效成分均可能通過調節circ_0001742 而抑制鼻咽癌發生發展[13]。本研究結果顯示,白頭翁皂苷 D 作用后甲狀腺癌細胞活力降低,克隆形成數減少,且呈劑量依賴性,提示白頭翁皂苷 D 可抑制甲狀腺癌細胞增殖及克隆形成。E-cadherin、N-cadherin 屬于上皮-間質轉化(EMT)相關蛋白,其表達異常與 EMT 轉化密切相關,而 EMT 轉化可促進細胞轉移[14]。本研究結果顯示,不同劑量的白頭翁皂苷 D 作用后甲狀腺癌遷移及侵襲能力降低,并可抑制 N-cadherin 表達而促進 E-cadherin 表達,且呈劑量依賴性。提示白頭翁皂苷 D 可抑制甲狀腺癌細胞遷移及侵襲。但白頭翁皂苷 D 調節甲狀腺癌細胞生物學行為的分子機制尚需進一步驗證。

本研究發現,隨著白頭翁皂苷 D 濃度的不斷增加,甲狀腺癌細胞中 circ_0001178 的表達量逐漸降低,而 miR-885-5p 的表達量逐漸升高,提示白頭翁皂苷 D 可能通過抑制circ_0001178 的表達及促進 miR-885-5p 的表達而發揮抗甲狀腺癌的作用。研究表明 circ_0001178 在肝細胞癌中表達上調,并可通過調節 miR-382 / VEGFA 軸而促進肝細胞癌的進展[15]。本研究結果顯示,干擾 circ_0001178 表達后 miR-885-5p 的表達量升高,甲狀腺癌細胞活力降低,克隆形成數、遷移及侵襲細胞數減少,提示干擾 circ_0001178 表達可能通過上調 miR-885-5p 的表達而抑制甲狀腺癌細胞的生物學行為。本研究證實甲狀腺癌細胞中 circ_0001178 可靶向結合 miR-885-5p,并可負向調控 miR-885-5p 的表達。研究表明 miR-885-5p 通過調節β-catenin抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲[16]。miR-885-5p 可通過抑制 Wnt/β-catenin 信號通路而抑制肝細胞癌轉移。本研究結果顯示,miR-885-5p 過表達后甲狀腺癌細胞活力降低,克隆形成數、遷移及侵襲細胞數減少,而 circ_0001178 過表達或抑制 miR-885-5p 表達均可部分逆轉白頭翁皂苷 D 對甲狀腺癌細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的作用。

綜上所述,白頭翁皂苷 D 可抑制甲狀腺癌細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲,抑制circ_0001178 的表達能夠促進 miR-885-5p 的表達,而白頭翁皂苷 D 抗甲狀腺癌的分子機制與調控 circ_0001178/miR-885-5p 分子軸有關,即白頭翁皂苷 D 可通過抑制 circ_0001178 的表達而促進 miR-885-5p 的表達進而發揮作用,可為進一步揭示甲狀腺癌的發病機制提供理論基礎,還可為研發甲狀腺癌的治療藥物提供新方向。