黑平菇及白色變異平菇單核菌株的遺傳多樣性分析

夏會楠 李東曉 周金看 王春霞 郭金英 鄭素月

夏會楠，李東曉，周金看，等. 黑平菇及白色變異平菇單核菌株的遺傳多樣性分析［J］. 江蘇農業科學，2024，52（7）：41-47.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.07.006

（河北工程大學園林與生態工程學院，河北邯鄲 056038）

摘要：以篩選平菇雜交過程中優良菌株為目標，分析黑平菇以及白色變異平菇單核菌株遺傳多樣性。用24個白色變異平菇原生質體單核菌株以及37個黑平菇原生質體單核菌株為試驗材料，采用酯酶同工酶技術以及ISSR分子標記技術對其單核菌株進行遺傳多樣性分析。結果表明，酯酶同工酶白色變異原生質體單核菌株菌株共檢測出7條遷移率不同的酶帶，黑平菇單核菌株共檢測出8條遷移率不同的酶帶，多態性條帶分別占65.8%、75%；ISSR分子標記技術將平菇白色變異單核菌株以及黑平菇單核菌株的原生質體單核菌株從5個ISSR引物中分別擴增出68、74條清晰的DNA多態片段，多態性位點分別占78.5%、63%。兩類聚類分析結果表明，當GS為0.75時，將24個平菇白色變異菌株單核菌株分為兩大類；當GS為0.79左右時，將37個黑平菇單核菌株分為兩大類。說明酯酶同工酶技術以及ISSR分子標記技術可以用于單核菌株遺傳多樣性分析，為平菇雜交育種過程中優良親本單核體的選擇提供理論依據。

關鍵詞：平菇；單核菌株；酯酶同工酶；ISSR分子標記

中圖分類號：S646.1+40.32? 文獻標志碼：A? 文章編號：1002-1302（2024）07-0041-07

平菇是具有食用性和藥用性的可食用性大型子實體真菌，生長周期短收益快，且含有人體所需的大量生物活性物質、礦物質和維生素，蛋白質含量高，脂肪含量低，具有非常高的營養價值，已成為人們的重要蔬菜。平菇是典型的四極性異宗結合菌。四極性異宗結合菌，交配型是由A、B這2對因子控制，同一菌株產生的擔孢子分為4種不同交配型：A1B1、A2B2、A1B2、A2B1，只有A、B這2個因子各不相同時才能進行交配［1-2］。原生質體單核菌株只有2種交配型。平菇雙核菌株通過單核化技術回到質配前的單核狀態，是擔子菌獨特的生物學現象，原生質體單核化是平菇遺傳育種上的一個重要節點，單核菌株具有遺傳多樣性，是研究平菇遺傳性狀以及基因定位的重要材料，同時單核菌株也為平菇雜交育種提供了重要的種質資源。

酯酶同工酶技術是從蛋白質水平上研究單核菌株之間的遺傳差異性，廣泛應用于親緣關系鑒定以及遺傳差異研究中［1-2］。但酯酶同工酶僅僅只能從蛋白質水平研究單核菌株遺傳差異，不能分析DNA水平上單核菌株遺傳差異，因此要更進一步采用ISSR分子標記技術對單核菌株遺傳差異性進行研究［3-4］。ISSR分子標記技術是基于SSR發展起來的新技術，具有穩定性及多態性，能夠更好地分析單核菌株之間的遺傳差異性［5-7］。筆者采用酯酶同工酶以及ISSR分子標記技術對白色變異平菇菌株的24個單核菌株以及黑色出發菌株的37個單核菌株進行遺傳多樣性分析，以期為食用菌育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2023年2—5月在河北工程大學食用菌研究室內進行，試驗所需平菇白色變異菌株是在平菇系統選育過程中發現的白色變異菌株，試驗所需變異白平菇原生質體單核體，分別編號為B1～B24，黑色出發菌株原生質體單核體H1～H37，由河北工程大學食用菌研究室鑒定、保藏。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌絲體培養

將變異的白色平菇以及黑色出發菌株接種于PDA平板上進行培養。

1.2.2 單核菌株收集

通過原生質體制備獲得單核菌株，將單核菌株接種至鋪有玻璃紙的PDA平板上進行培養，菌絲長滿平板后刮取菌絲備用。

1.2.3 酯酶同工酶分析

將備用菌絲放入研缽中，加入液氮快速研磨，取0.5 g菌絲加入700 μL pH值為7.5的磷酸鹽緩沖液，混勻后加入離心管19 ℃ 12 000 r/min 離心5 min取上清液。使用DYC2-24EN型雙垂直電泳儀進行垂直電泳。

1.2.4 ISSR分子鑒定

采用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒提取單核菌株DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度及質量，進行凝膠成像拍照，剩余DNA放在-20 ℃保存備用，后期進行PCR擴增，擴增體系見表1。所采用的ISSR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 數據分析

利用NTSYS-PC軟件進行聚類分析，打開Ntsys 軟件中的ntedit.exe程序以及NTSYS-PC程序，用非加權組平均法（UPGMA）構建各菌株的親緣關系樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 酯酶同工酶分析

2.1.1 白色變異平菇酯酶同工酶

酯酶同工酶分析結果表明，24個白色變異平菇原生質體單核菌株共檢測到7條不同遷移率的酶帶，相對遷移率（Rf）在0.23～0.63之間，各個單核菌株酶帶數量在4～7條，多態性帶型占65.8%，部分平菇白色變異單核菌株酯酶同工酶圖譜見圖1。

2.1.2 白色變異平菇酯酶同工酶聚類分析

聚類分析樹狀圖見圖2。由圖2可知，供試的24個白色變異平菇單核菌株間的遺傳相似系數（GS）為0.6～1.0，當GS為0.685時可將菌株分為2組，根據樣本量依次分為A、B 2組。A組為B1、B2等20個菌株，B組為B17、B18、B19、B20等4個菌株。

2.1.3 黑色出發平菇酯酶同工酶分析

酯酶同工酶分析結果表明，37個黑色平菇原生質體單核菌株共檢測到8條不同遷移率的酶帶，相對遷移率在014～0.47之間，各個單核菌株酶帶數量在3～7條，多態性帶型占75%，部分黑平菇單核菌株酯酶同工酶圖譜見圖3。

2.1.4 黑平菇酯酶同工酶聚類分析

由圖4聚類分析樹狀圖可知，供試的37個平菇單核菌株間的遺傳相似系數（GS）為0.58～1.00，當GS為0.66時可將菌株分為2組，根據樣本量依次分為A、B 2組。A組為H1、H2等33個菌株，B組為H13、H14、H15、H16等4個菌株。

2.2 ISSR引物篩選及聚類分析

2.2.1 DNA檢測

24株白色變異平菇單核菌株DNA質量檢測結果如圖5所示，有明顯的DNA條帶，可進行后續擴增試驗。黑色出發菌株部分DNA檢測結果如圖6所示，有明顯DNA條帶，可進行后續擴增試驗。

2.2.2 ISSR引物篩選

從28個引物（表2）中篩選出5個擴增條帶清晰的引物，對24個白色變異單核菌株進行PCR擴增，均能擴增出清晰的條帶，分別是P2、P4、P5、P9、P22、P22、P9的擴增圖譜分別如圖7、圖8所示，5個引物對24個平菇白色變異單核菌株共擴增出73條清晰條帶。擴增條帶最多的引物是P22，擴增條帶最少的引物是P5，擴增出14條條帶。多態性位點占78.5%。

2.2.3 24個平菇單核菌株的ISSR聚類分析

將24個平菇單核菌株的DNA擴增圖譜轉化成GS矩陣圖，再利用NTSYS-PC軟件UPGMA法進行聚類分析，構建單核菌株親緣關系圖。由圖9可知，24個單核菌株GS在0.58～1.00之間，當遺傳相似系數為0.75時可將24個平菇單核菌株分為兩大類，A類有B1、B2等20個菌株，B類有B17、B18、B19、B20等4個菌株，與酯酶同工酶分析結果一致。

2.2.4 黑平菇菌株ISSR引物篩選

從28個引物（表2）中篩選出4個擴增條帶清晰的引物（P6、P11、P19、P22），對37個黑平菇原生質體單核菌株進行PCR擴增均能擴增出清晰的條帶。P22、P6的擴增圖譜分別如圖10、圖11所示。 4個引物對37個平菇單核菌株共擴增出64個清晰的條帶。擴增條帶最多的引物是P22，擴增出16條條帶，擴增條帶最少的是P5，擴增出5條條帶。多態性位點占63%。

2.2.5 37個黑平菇單核菌株的ISSR聚類分析

將37個平菇單核菌株的DNA擴增圖譜轉化成GS矩陣圖，再利用NTSYS-PC軟件UPGMA法進行聚類分析，構建單核菌株親緣關系聚類分析圖。由圖12可知， 供試的37個單核菌株GS在?0.78～1.00之間，當遺傳相似系數為0.79時可將37個平菇單核菌株分為兩大類，A類有H1、H2等33個單核菌株，B類有H13、H14、H15、H16等4個菌株，與酯酶同工酶分析結果一致。

3 討論與結論

在生產中，為達到育種目標提高生產力，單核菌株遺傳差異研究在食用菌育種中起著非常重要的作用，為平菇雜交育種提供優質的種質資源［8-10］。酯酶同工酶分析、ISSR分子標記技術已經廣泛應用于食用菌雜交育種、種質資源鑒定以及單核菌株遺傳差異研究［11］。本試驗在酯酶同工酶分析的基礎上又進行了ISSR分子標記技術進一步研究了白色變異平菇單核菌株遺傳差異性，便于挑出優良單核菌株用于育種工作。根據聚類分析圖來看，遺傳相似性基本一致。酯酶同工酶試驗在24個單核菌株中共檢測出7條遷移率不同的酶帶，多態性帶型占658%。24個平菇單核菌株間的遺傳相似系數（GS）在0.6～1.0之間，當GS為0.685時可將菌株分為2組，根據樣本量依次分為A、B 2組。A組為B1、B2等20個菌株，B組為B17、B18、B19、B20等4個菌株，并且Rf為0.63的條帶為24個單核菌株所共有的，可以認為是白色變異平菇單核體的特征譜帶。ISSR分子標記技術用篩選出的5條引物對24個平菇單核菌株的DNA進行ISSR擴增，24個平菇單核菌株共擴增出73條清晰條帶。擴增條帶最多的引物是P22，擴增條帶最少的引物是P5，擴增出14條條帶，多態性位點占78.5%。當GS為0.75時，將24個菌株分為兩大類。平菇黑色出發菌株分別分離出單核菌株37個，平菇黑色出發菌株原生質體單核菌株酯酶同工酶試驗共檢測出8條遷移率不同的酶帶，多態性帶占75%。ISSR分子標記技術將平菇黑色出發菌株的原生質體單核菌株從5個ISSR引物中分別擴增出64條清晰的DNA多態片段，多態性位點分別占63%，兩類聚類分析結果表明，當GS為0.79左右時，將37個黑色出發菌株分[21]為兩大類。酯酶同工酶分析以及ISSR分子標記技術均可以作為單核菌株遺傳差異研究的技術手段。通過酯酶同工酶以及分子標記技術研究單核菌株遺傳差異大體分類相同之間的小分支還有所差異。ISSR分子標記技術對黑色出發菌株以及白色變異菌株的單核菌株進行了具體的遺傳多樣性分析，當GS為0.75時，將白色變異菌株24個菌株分為兩大類。當GS為0.79左右時，將黑色出發菌株37個菌株分為兩大類。酯酶同工酶試驗結果表明，平菇黑色出發菌株以及平菇白色變異菌株遺傳系相接近，在遺傳相似系數在0.75左右能將其分為兩大類。綜上所述，平菇白色變異菌株的單核菌株遺傳多樣性不同于黑色出發菌株。這為平菇擴充種質資源庫奠定了基礎。

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基金項目：河北省高等學校學科技術研究項目（編號：QN2021210）；邯鄲市科技技術研究與發展計劃（編號：21422012326）；河北省農業科技成果轉化項目（編號：202360101010014）。

作者簡介：夏會楠（1998—），女，河北承德人，碩士，研究方向為食藥用真菌。E-mail：2199797807@qq.com。

通信作者：鄭素月，博士，教授，碩士生導師，從事食用菌遺傳育種研究工作。E-mail：zhengsuyue@sina.com。