鵝星狀病毒RdRp蛋白對細胞因子轉錄水平的影響

饒丹 尹磊 吳佩 王媛媛 何書海 張寧 董建國

饒 丹，尹 磊，吳 佩，王媛媛，等. 鵝星狀病毒RdRp蛋白對細胞因子轉錄水平的影響［J］. 江蘇農業科學，2024，52（7）：164-168.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.07.022

（1.信陽農林學院動物科技學院，河南信陽 464000； 2.河南牧業經濟學院，河南鄭州 450046； 3.河南豐源和普農牧股份有限公司，河南漯河 462000）

摘要：為了解鵝星狀病毒（GAstV）RdRp蛋白對細胞因子轉錄水平的影響，試驗將構建的pCMV-RdRp真核質粒轉染293細胞，并于轉染后12、24、36 h收集細胞，提取核酸檢測細胞內CCL2、CCL5、IL-1β、IFN-α、TNF-α、IFITM1和IFITM2的轉錄水平。結果發現，GAstV RdRp蛋白于12、24、36 h極顯著抑制CCL2轉錄，12 h極顯著促進CCL5表達，24、36 h極顯著抑制CCL5表達（P<0.01）；GAstV RdRp蛋白于24、36 h極顯著促進IL-1β轉錄（P<0.01）；GAstV RdRp蛋白于12 h極顯著促進IFN-α的轉錄，于24、36 h極顯著抑制IFN-α轉錄（P<0.01）；GAstV RdRp蛋白于12、24、36 h顯著或極顯著抑制TNF-α轉錄（P<0.01）；GAstV RdRp蛋白于24 h極顯著抑制IFITM1轉錄（P<0.01），于36 h顯著抑制轉錄（P<0.05），于12、36 h極顯著促進IFITM2轉錄（P<0.01），于24 h極顯著抑制IFITM2的轉錄（P<0.01）。表明GAstV RdRp蛋白過表達能夠誘導IL-1β的轉錄，抑制CCL2、TNF-α和IFITM1的轉錄；GAstV RdRp蛋白早期促進CCL5和IFN-α的轉錄，后期抑制CCL5和IFN-α的轉錄；GAstV RdRp蛋白早期和晚期促進IFITM2轉錄，中期抑制IFITM2轉錄。

關鍵詞：鵝星狀病毒；細胞因子；轉錄；RdRp蛋白

中圖分類號：Ｓ８５２.６５＋７? 文獻標志碼：A? 文章編號：1002-1302（2024）07-0164-05

星狀病毒（astrovirus，AstV）是一種無囊膜、單股正鏈RNA病毒。根據感染宿主能力不同，星狀病毒可分為哺乳動物星狀病毒和禽星狀病毒［1］。禽星狀病毒主要感染雞、火雞、鴨、鵝等，在不同的宿主引起的癥狀不同。2017年以來，一種以痛風為主要癥狀的傳染性疾病在我國東南沿海和內陸省份主要養鵝地區暴發，研究顯示這種感染主要是由鵝星狀病毒（goose astrovirus，GAstV）引起，鵝場小鵝的死亡率超過50%［2-5］。尸檢顯示有嚴重的內臟和關節尿酸沉積癥狀，研究顯示病鵝腎臟的病毒拷貝數最高，其次是脾臟和肝臟［6］。這種疾病給養鵝業造成了巨大的經濟損失。

GAstV在2005年出現痛風癥狀的小鵝病料中被首次發現［7］。GAstV基因組共有3個開放閱讀框（open reading frame，ORF）：ORF1a、ORF1b和ORF2。星狀病毒的ORF1a和ORF1b存在重疊區，ORF1a和ORF1b編碼非結構蛋白（non-structural protein，NSP），包括跨膜區域（transmembrane，TM）、絲氨酸蛋白酶、卷曲螺旋（coiled-coil，CC）、病毒基因組連接蛋白（viral genome-linked protein，VPg）、核定位信號（nuclear localization signal，NLS）及RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）。ORF2編碼衣殼蛋白（capsid protein，CP），其中，ORF1a編碼多聚蛋白，ORF1b編碼RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）蛋白［8］。RdRp能夠催化mRNA合成，并通過互補RNA中間體復制RNA病毒基因組。同時，病毒需要以受控的方式生成這些RNA物種，與宿主細胞激烈競爭資源進行繁殖。流感病毒在RNA合成的每一步均利用宿主因子增強和調節RdRp活性［9］。豬細胞白介素-2增強劑結合因子2能夠和豬繁殖與呼吸綜合征病毒RdRp相互作用，抑制病毒復制［10］。這些研究表明，了解病毒RdRp調控病毒和宿主的機制，研制針對RdRp的藥物，在預防和治療病毒感染腫脹方面具有重要意義。AstV可感染多個宿主，目前對于AstV的RdRp蛋白調控宿主機制研究較少。[JP2]

細胞因子在病毒增殖中具有重要作用。研究顯示，CCL2、CCL5、IL-1β和TNF-α能夠影響HIV-1、[JP]甲型流感病毒、乙型肝炎病毒和貓傳染性腹膜炎病毒的增殖［11-14］。且腎臟中IL-1β和 TNF-α 的表達水平與鵝星狀病毒引起的痛風有關［15］，而IFN和抗病毒蛋白具有重要的抗病毒特性。為研究鵝星狀病毒的致病機制，本研究初步探索GAstV RdRp蛋白對CCL2、CCL5、IL-1β、IFN-α、TNF-α、IFITM1和IFITM2轉錄水平的影響，以期為開放抗病毒藥物提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞和質粒

293細胞由信陽農林學院動物科技學院免疫病理實驗室凍存；表達GAstV RdRp蛋白的真核質粒pCMV-RdRp-HA由信陽農林學院動物科技學院免疫病理實驗室構建保存，本試驗于2022年12月在信陽農林學院動物科技學院免疫病理實驗室進行。

1.1.2 試驗試劑

核酸提取試劑DNA/RNA Extraction Kit FT（Prepackaged）、反轉錄試劑盒（1st Strand cDNA Synthesis Kit＋gDNA wiper）、熒光定量試劑AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（High ROX Premixed），購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；細胞因子CCL2、CCL5、IL-1β、TNF-α、IFNα和抗病毒蛋白IFITM基因定量檢測引物，由金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

從液氮中復蘇293細胞，于5%二氧化碳的培養箱在含有10%胎牛血清和雙抗的DMEM培養基中培養，并鋪入12孔板中，待細胞密度達90%時進行轉染。

1.2.2 質粒轉染

每孔細胞使用50 μL無血清培養基稀釋 0.6 μg 真核質粒pCMV-RdRp-HA。同時，將 1.2 μL LipofectamineTM 2000試劑加入50 μL無血清培養基。隨后將兩者混合，室溫靜置20 min，隨后將混合物加入細胞培養孔中，分別于轉染后12、24、36 h收集細胞于-80 ℃保存備用。

1.2.3 核酸的提取

使用FastPure Cell Total RNA Isolation Kit試劑盒提取細胞中的總RNA，具體操作如下：將細胞加入Buffer RL，漩渦振蕩，轉移至收集管中，直至無明顯細胞團，12 000 r/min離心2 min。收集上清液，加入Buffer RL2（已加入無水乙醇），輕柔混勻，轉移至RNA? Pure Columns中（RNA Pure Columns已放入收集管中），12 000 r/min離心 1 min，棄廢液。將剩余的液體全部加入吸附柱中，12 000 r/min 離心 1 min，棄廢液，重復1次。向RNA Pure Columns中加入Buffer RW2（已加入無水乙醇），[JP]12 000 r/min離心1 min，棄廢液，12 000 r/min離心2 min。向吸附柱中央部位懸空滴加100 μL RNase-free ddH2O。室溫放置2 min，12 000 r/min離心1 min，洗脫RNA。提取的RNA放于-80 ℃保存備用。

1.2.4 細胞因子檢測

將提取的RNA進行反轉錄，反轉錄體系如下：5×gDNA wiper Mix 2 μL，RNA 8 μL，5×RT Mix 2 μL，HiScript Ⅲ Enzyme Mix 2 μL，Random hexamers 1 μL，RNase-free ddH2O 5 μL。反應程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。隨后采用染料法對細胞中的CCL2、CCL5、IL-1β、TNF-α和IFITM的轉錄水平進行定量檢測。定量檢測引物如下：CCL2F：5′-GCCTCCAGCATGAAAGTCTC-3′，CCL2R：5′-AGGTGACTGGGGCATTGAT-3′；CCL5F：5′-CTGCCTCCCCATATTCCTCG-3′，CCL5R：5′-CACACTTGGCGGTTCTTTCG-3′；IL-1βF：5′-[JP9]AGGCACAAGGCACAACAGGCT-3′，IL-1βR：5′-AACAACTGACGCGGCCTGCC-3′；TNF-αF：5′-CCCTCTGGCCCAGGCAGTCA-3′，TNF-αR：5′-ATGGGTGGAGGGGCAGCCTT-3′；IFITM1F：5′-TCAGGTCAAGGATAGTCTGGAG-3′，IFITM1R：5′-AGGTTGTGTATTCCCACACTGTA-3′；IFITM2F：5′-GGAGGGAGAAAACTCCTTGGA-3′，IFITM2R：5′-GGCCAGTAGGTTGCACATTGT-3′。反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，40個循環。

1.2.5 數據處理

使用2-ΔΔCT方法計算檢測基因的相對表達水平，采用GraphPad Prism 5軟件進行統計分析。所有數據均以“平均值±標準差”表示。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 GAstV RdRp蛋白影響CCL2、CCL5的轉錄

293細胞轉染pCMV-RdRp真核質粒，轉染后12、24、36 h收集細胞，檢測細胞中CCL2和CCL5基因的轉錄水平。由圖1可知，RdRp蛋白于12、24、36 h極顯著抑制CCL2轉錄（P<0.01），12 h極顯著促進CCL5表達（P<0.01），24、36 h極顯著抑制CCL5表達（P<0.01）。

2.2 GAstV RdRp蛋白影響IL-1β的轉錄

293細胞轉染pCMV-RdRp真核質粒，轉染后12、24、36 h收集細胞，檢測細胞中IL-1β的轉錄水平。由圖2可知，RdRp蛋白于24、36 h極顯著促進IL-1β的轉錄（P<0.01）。

2.3 GAstV RdRp蛋白對IFN-α轉錄的影響

293細胞轉染pCMV-RdRp真核質粒，轉染后12、24、36 h收集細胞，檢測細胞中IFN-α的轉錄水平。由圖3可知，RdRp蛋白于12 h極顯著促進IFN-α的轉錄（P<0.01）， 于24、36 h極顯著抑制IFN-α的轉錄（P<0.01）。

2.4 GAstV RdRp蛋白對TNF-α轉錄的影響

293細胞轉染pCMV-RdRp真核質粒，轉染后12、24、36 h收集細胞，檢測細胞中TNF-α的轉錄水平。由圖4可知，RdRp蛋白于12 h顯著抑制TNF-α的轉錄（P<0.05），于24、36 h極顯著抑制TNF-α轉錄（P<0.01）。

2.5 GAstV RdRp蛋白影響IFITM的轉錄

293細胞轉染pCMV-RdRp真核質粒，轉染后12、24、36 h收集細胞，檢測細胞中IFITM1和IFITM2的轉錄水平。由圖5可知，RdRp蛋白于?24 h 極顯著抑制IFITM1轉錄（P<0.01），于36 h顯著抑制IFITM1的轉錄（P<0.05），于12、36 h極顯著促進IFITM2的轉錄，于24 h極顯著抑制IFITM2轉錄（P<0.01）。

3 討論與結論

自2016年末，我國許多養鵝地區頻繁發生以雛鵝痛風為主要癥狀的疫病，發病率高達80%，死亡率在20%～70%之間，給我國養鵝業的發展造成了巨大經濟損失［16］。痛風主要引起3周齡以內雛鵝

發病，病鵝肝臟、脾臟和腎臟等內臟器官表面及關節腔有大量的尿酸鹽沉積。研究發現，引起該疫病的主要原因是一種新型星狀病毒——鵝星狀病毒，病毒具有廣泛的組織嗜性，主要侵害腎臟［17］。

在痛風發生過程中，炎癥反應發揮重要作用。病毒感染宿主后，往往通過自身蛋白調節宿主信號通路，影響細胞因子的表達，利于自身的增殖和擴散。趨化因子是白細胞（包括：單核細胞、T細胞和自然殺傷細胞）的趨化劑。CCL2在宿主的先天免疫反應中發揮重要作用，CCL2可吸引單核細胞和T淋巴細胞到病原體感染部分，進而引發一系列炎癥反應。人類免疫缺陷病毒（HIV-1）感染人原代巨噬細胞誘導CCL2表達，HIV-1感染的巨噬細胞和外周血單核細胞中，CCL2 mRNA水平均升高［18］。丙型肝炎病毒core蛋白通過NF-kB通路誘導巨噬細胞中CCL2的表達［19］。與低毒力相比，感染高毒力的非洲豬瘟病毒能夠誘導豬血液中CCL2的表達上調［20］。研究顯示，CCL2和CCL5能夠促進病毒增殖。CCL2有助于病毒自身蛋白Gag-p6介導的HIV-1的釋放［11］。CCL5通過上調SAMHD1水平抑制甲型流感病毒的復制［12］。本研究顯示，GAstV RdRp蛋白過表達能夠抑制CCL2的表達，而對于CCL5，RdRp蛋白過表達后早期促進CCL5表達，后期抑制CCL5表達。同時，GAstV RdRp蛋白過表達后早期促進IFN-α轉錄，后期抑制IFN-α轉錄，且影響抗病毒蛋白IFITM1和IFITM2的轉錄水平。趨化因子在病毒感染宿主后，在宿主體內廣泛擴散中發揮重要作用，而IFN和抗病毒蛋白具有重要的抗病毒特性。這些因子的改變是否會導致GAstV廣泛的組織嗜性，利于病毒增殖有待進一步研究。

研究顯示，許多病毒感染會導致炎癥反應劇烈發生，產生的炎癥因子進一步影響病毒的增殖。白細胞介素（IL）-1β是一種關鍵的先天細胞因子，對免疫激活和促進炎癥過程至關重要。流感病毒H1N1感染導致兒童體內IL-1β的表達上調［21］，禽流感病毒感染導致雞巨噬細胞分泌IL-1β［22］。IL-1β 能夠抑制體內乙型肝炎病毒的復制，而乙型肝炎病毒通過抑制NF-κB信號通路進而抑制由LPS激活的炎性小體的激活和IL-1β的產生，從而逃避宿主的先天性免疫反應［20］。犬流感病毒感染巨噬細胞后，誘導TNF-α的分泌和細胞死亡［23］。貓傳染性腹膜炎病毒感染巨噬細胞，誘導TNF-α的分泌，上調Ⅱ型貓傳染性腹膜炎病毒受體貓氨基肽酶N在貓巨噬細胞中的表達，利于病毒感染［14］。豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染巨噬細胞后誘導TNF-α的分泌，進而抑制豬瘟病毒的復制，致使臨床上出現豬繁殖與呼吸綜合征感染，導致豬瘟疫苗免疫失敗［24］。在對患痛風雛鵝腎臟中相關炎性因子和炎性信號分子的表達水平進行研究時顯示，腎臟中 IL-1β 和TNF-α的表達水平顯著升高，導致雛鵝腎臟出現嚴重的炎性損傷［15］。本研究顯示，GAstV RdRp蛋白顯著誘導IL-1β的轉錄水平，抑制 TNF-α 的轉錄水平。TNF-α的轉錄水平下降是否會促進GAstV的增殖，而GAstV的增殖是否會導致病毒蛋白RdRp誘導IL-1β的產生，進而導致腎臟的損傷和尿酸鹽沉積，其具體機制有待于進一步深入研究。

本研究顯示，GAstV RdRp蛋白過表達能夠誘導IL-1β的轉錄，抑制CCL2、TNF-α和IFITM1的轉錄；早期促進CCL5和IFN-α的轉錄，后期抑制CCL5和IFN-α的轉錄；早期和晚期促進IFITM2轉錄，中期抑制IFITM2轉錄。

參考文獻：

［1］張 紅，田秋豐，陳志峰，等. 鵝星狀病毒病原學研究進展［J］. 家禽科學，2023，45（2）：53-56.

［2］施朝輝. 仔鵝痛風病流行病學調查［J］. 中國畜禽種業，2019，15（11）：168-169.

［3］岳 穩，張 瑞，黃 瑜，等. 揚州鵝關節痛風病例的診斷及病原鑒定［J］. 福建畜牧獸醫，2020，42（6）：25-26.

［4］章麗嬌，黃欣梅，劉 飛，等. 新型鵝星狀病毒AHQJ18株的分離鑒定［J］. 江蘇農業學報，2019，35（5）：1262-1264.

［5］李甜甜，王鉅華，朱國強，等. 鵝星狀病毒的分離鑒定及其致病性研究［J］. 中國家禽，2020，42（10）：116-120.

［6］Madeley C R，Cosgrove B P. Letter：viruses in infantile gastroenteritis［J］. Lancet，1975，2（7925）：124.

［7］Liu C G，Sun M H，Liao M. A review of emerging goose astrovirus causing gout［J］. BioMed Research International，2022，2022：1635373.

［8］付新亮，江丹莉，侯展鵬，等. 致雛鵝痛風新型鵝星狀病毒研究進展［J］. 中國預防獸醫學報，2021，43（7）：786-790.

［9］Peacock T P，Sheppard C M，Staller E，et al. Host determinants of influenza RNA synthesis［J］. Annual Review of Virology，2019，6（1）：215-233.

［10］Wen X X，Bian T，Zhang Z B，et al. Interleukin-2 enhancer binding factor 2 interacts with the nsp9 or nsp2 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and exerts negatively regulatory effect on the viral replication［J］. Virology Journal，2017，14（1）：125.

［11］Ajasin D O，Rao V R，Wu X H，et al. CCL2 mobilizes ALIX to facilitate Gag-p6 mediated HIV-1 virion release［J］. eLife，2019，8：e35546.

［12］Silva T，Temerozo J R，do Vale G，et al. The chemokine CCL5 inhibits the replication of influenza a virus through SAMHD1 modulation［J］. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology，2021，11：549020.

［13］Yu X，Lan P X，Hou X B，et al. HBV inhibits LPS-induced NLRP3 inflammasome activation and IL-1β production via suppressing the NF-κB pathway and ROS production［J］. Journal of Hepatology，2017，66（4）：693-702.

［14］Takano T，Hohdatsu T，Toda A，et al. TNF-alpha，produced by feline infectious peritonitis virus （FIPV）-infected macrophages，upregulates expression of type Ⅱ FIPV receptor feline aminopeptidase N in feline macrophages［J］. Virology，2007，364（1）：64-72.

［15］Xi Y M，Yan J S，Li M Y，et al. Gut microbiota dysbiosis increases the risk of visceral gout in goslings through translocation of gut-derived lipopolysaccharide［J］. Poultry Science，2019，98（11）：5361-5373

［16］金前躍，郭永剛，李俊朋，等. 鵝星狀病毒XX株的分離鑒定及遺傳特征分析［J］. 河南農業科學，2021，50（6）：134-141.

［17］Zhu Q H，Sun D B. Goose astrovirus in China：a comprehensive review［J］. Viruses，2022，14（8）：1759.

［18］Mengozzi M，de Filippi C，Transidico P，et al. Human immunodeficiency virus replication induces monocyte chemotactic protein-1 in human macrophages and U937 promonocytic cells［J］. Blood，1999，93（6）：1851-1857.

［19］Song X T，Gao X，Wang Y D，et al. HCV core protein induces chemokine CCL2 and CXCL10 expression through NF-κB signaling pathway in macrophages［J］. Frontiers in Immunology，2021，12：654998.

［20］Fishbourne E，Hutet E，Abrams C，et al. Increase in chemokines CXCL10 and CCL2 in blood from pigs infected with high compared to low virulence African swine fever virus isolates［J］. Veterinary Research，2013，44（1）：87.

［21］Chiaretti A，Pulitanò S，Barone G，et al. IL-1 β and IL-6 upregulation in children with H1N1 influenza virus infection［J］. Mediators of Inflammation，2013，2013：495848.

［22］Abdul-Cader M S，de Silva Senapathi U，Nagy E，et al. Antiviral response elicited against avian influenza virus infection following activation of toll-like receptor （TLR）7 signaling pathway is attributable to interleukin （IL）-1β production［J］. BMC Research Notes，2018，11（1）：859.

［23］Powe J R，Castleman W L. Canine influenza virus replicates in alveolar macrophages and induces TNF-alpha［J］. Veterinary Pathology，2009，46（6）：1187-1196.

［24］Chen D J，Liu X W，Xu S K，et al. TNF-α induced by porcine reproductive and respiratory syndrome virus inhibits the replication of classical swine fever virus C-strain［J］. Veterinary Microbiology，2019，234：25-33.

基金項目：信陽農林學院青年教師基金（編號：QN2021010）；2023年度河南省重點研發與推廣專項（科技攻關）資助項目（編號：232102111043）；河南省高等學校青年骨干教師培養計劃；信陽農林學院家禽重大疫病防控科技創新團隊資助項目（編號：2022CXTD06）。

作者簡介：饒 丹（1988—），女，江西南昌人，碩士，講師，主要從事動物病毒學研究。E-mail：raodan2007@126.com。

通信作者：董建國，博士，副教授，主要從事動物病毒學研究。E-mail：dongjianguo213@163.com。