蒙脫石與復合菌劑配施提高田菁改良鹽漬土的效果

關鍵詞： 鹽脅迫； 田菁； 蒙脫石； 微生物菌劑； 脫鹽率； 土壤養分

土壤鹽漬化是全球范圍內農業經濟的制約因素之一[1]，全球受鹽脅迫危害的土壤面積約為 9.5×108 hm2，約占總土地面積的10％[2]。我國黃河三角洲鹽漬化土壤占全國可利用土地面積的5.01%[3]，嚴重制約該地區農業可持續發展[4?5]。

鹽漬土中含有較高水平的可溶性鹽，主要是NaCl，其通過滲透作用改變植物營養平衡和代謝過程從而影響作物生長[6]。黃河三角洲鹽堿地鈉離子濃度大、pH 高，導致土壤質量下降作物不易生長[7]，大面積的鹽堿地造成我國國土資源的浪費，并且威脅著我國的糧食安全[8]，如何提高鹽堿地糧食產量是近年來研究的熱點問題之一。

納米材料是指具有外部納米級（1～1000 nm） 或內部納米級表面結構的材料[5]，蒙脫石是常見的可膨脹的粘土礦物，其層狀結構中含有大量交換性陽離子，是天然的納米材料[9]。由于具有較大的比表面積且內部孔道結構特殊，蒙脫石常被當作吸附劑[10]用于土壤修復。種植耐鹽植物也是常用的土壤修復技術，尤其在鹽堿地修復方面發揮了重要作用[11]。鹽堿地代表性修復植物田菁（Sesbania cannabina） 屬于豆科植物，具有較強的耐鹽、耐澇、耐瘠能力[12]，已經用于我國黃河三角洲鹽堿地的修復。田菁內生菌是田菁發揮抗脅迫作用的主要原因之一，內生菌與植物共生可以保護植物免受生物和非生物脅迫，其產生的次生代謝物也是生物活性化合物的重要來源[13]。有研究表明，田菁內生菌可以促進多種水稻的發芽和生長[14]。

微生物菌劑近幾年發展迅速，也被廣泛用于農業尤其是鹽堿地修復[15?17]。微生物菌劑對環境友好，用于糧食作物生產具有穩定的增產增效效果，極大地促進了在農業生產上的使用。蒙脫石是層狀硅酸鹽黏土，具有顯著的生物相容性，能夠在外界壓力下促進細菌的生長和代謝[18]，將蒙脫石與微生物菌劑配合使用治理鹽堿土可能會提升微生物菌劑的效果。在本試驗中我們從田菁根內分離了兩株根際內生菌，經16S rDNA 鑒定兩株內生菌分別為假單胞菌ST3 （Pseudomonadaceae sp. ST3）、大腸桿菌ND2B （E. coli ND2B），我們將其與根瘤菌 YIC4027（Sinorhizobium alkalisoli YIC4027）[19]制備復合菌劑，與蒙脫石復配使用，分析其在不同鹽濃度梯度下提高植株抗鹽性的效果，以期為我國黃河三角洲地區鹽堿地土壤修復提供更為高效的技術。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：YIC4027 為本實驗室從田菁根際土壤中篩選得到的根瘤菌。已于2015-06-19 保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC No.10994。

供試土壤為采自山東東營渤海農場表層土（37°49′N，118°25′E）。土壤基本化學性質如下：有機質7.14 g/kg，pH 8.65，全氮0.787 g/kg，鈉離子141.25mg/kg，速效磷11.1 mg/kg，速效鉀167 mg/kg。

供試田菁種子為魯菁1 號，由山東省農業科學院提供。

蒙脫石k-10 購買于麥克林試劑公司，分子式為Al2O9Si3，pH 3～4，比表面積 240 m2/g，蒙脫石含量大于95%。

1.2 菌株分離純化

將田菁根用蒸餾水沖洗干凈，用研缽搗碎，稀釋涂布于NA 培養基、SCA 培養基、PDA 培養基上[20]，直至長出單菌落。純化單菌落，將已純化好的單菌落接種到 LB 液體培養基中，放于振蕩培養箱中，30℃、180 r/min 振蕩培養至對數生長期（OD600=0.8～1.0），取適量菌液加入甘油于?80℃ 冰箱保存。

1.3 菌株促生抗逆分析

將分離到的菌株分別接種在固體無氮培養基、無機磷培養基、缺鉀培養基上[21]，30℃ 培養7 天，每天記錄菌株生長情況。菌株產吲哚乙酸能力的測定參照 Shokri 等[ 2 2 ]的方法，產鐵載體能力參照Schwyn 等的方法[23]。

1.4 菌株分子生物學鑒定

ST3、ND2B 菌株具有較好促生耐鹽效果，用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取兩菌株的DNA。使用細菌1 6 S r R NA 通用引物2 7 F （ 5 ′ ? A G A G T TTGATCCTGGCTCAG?3′） 和1492R （5′?GGTTACCTTGTTACGACTT?3′） 對兩菌株DNA 進行PCR 擴增，將PCR 擴增產物用1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至青島睿博興科生物技術有限公司進行測序。

1.5 菌懸液的配制

將ST3、ND2B、YIC4027 活化，然后接種到裝有100 mL LB 液體培養基的錐形瓶中，于振蕩培養箱30℃、180 r/min 培養24 h；之后在4℃、8000 r/min條件下離心10 min，去除上清液，盡可能收集菌體沉淀，加入無菌水懸浮在4℃、8000 r/min 條件下離心5 min，反復洗滌3 次，最后重懸于無菌水中，菌懸液的OD600 值調整約為0.8 備用。

1.6 土壤處理

土壤暴曬至干燥后研磨，并過2 mm 篩。為確保土壤除菌，將多菌靈與水按照 1∶600 的體積比混合，均勻噴灑到土壤中，晾干備用。將土壤、蛭石、珍珠巖按照3∶1∶1 的體積比混勻，土為1 kg，裝入塑料花盆中。

1.7 試驗設計

將消毒后的田菁種子用菌懸液（ST3、ND2B、YIC4027 濃度為 1∶1∶1） 浸種5 h，對照處理的種子在相同條件下用無菌水處理。然后將種子放在水瓊脂培養基上，恒溫培養箱內30℃ 避光催芽 2 天，播種于塑料花盆。置于溫室（溫度 28℃，光照時間14 h/d） 中培養。每隔2 天澆1 次蒸餾水，每次控制水量一致。待田菁幼苗長出兩片葉子并充分展平時，間苗，每個花盆中保留2 株田菁幼苗。每隔1 天將濃度為100 mmol/L NaCl 溶液和200 mmol/LNaCl 溶液分別施加到對應處理的盆栽中，每次加入鹽溶液100 mL，對照處理加等量的水，共加3 次。1 周后加入濃度為109 CFUs /mL 的菌懸液20 mL 和用無菌水配制的濃度為8 g/L 的蒙脫石液體20 mL，對照處理加等量蒸餾水，每隔5 天每盆澆水300 mL，60 天后收獲。試驗共設12 個處理，每個處理重復3 次， 每個處理具體組合見表1。

1.8 生長參數測定

將田菁地上部及地下部分離之后殺青，烘干至恒重并記錄干重。植株收獲后測定土壤理化性質。

采用LA-S 植物根系分析系統（杭州萬深） 拍攝根系形態，采用萬深LA-S 根系分析系統分析根系掃描數據。其余數據通過Excel 2010 和SPSS 26 軟件進行處理和統計分析。

1.9 土壤理化性質和植株生理指標測定方法

土壤理化性質采用常規方法分析[24]，采用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法測定土壤速效磷，乙酸銨浸提—火焰光度法測定土壤速效鉀，濃硫酸消煮，全自動凱氏定氮儀測定全氮，重鉻酸鉀外加熱法測定有機碳，土壤pH 使用SARTORIUS PB-10 pH 計測定，使用電導法測定土壤含鹽量（雷磁電導率儀DDSJ-307F）。采用SPAD-502 葉綠素儀測定田菁葉片葉綠素含量，光合儀Li-6800 測定光合速率，硝基氮藍四唑（NBT） 還原法測定超氧化物歧化酶活性，紫外分光光度計測定田菁過氧化氫酶活性，愈創木酚比色法測定田菁過氧化物酶活性，硫代巴比妥酸法測定田菁丙二醛含量。

1.10 統計分析

試驗數據用Microsoft Excel 2010 處理，數據分析用SPSS 26 軟件。表和圖中表示的數據為平均值±標準差，n=3。通過單因素方差分析（ANOVA） 評價處理之間的差異顯著性。（Plt;0.05）。

2 結果與分析

2.1 田菁內生菌的功能分析

從促生結果（表2 ） 可以看出，假單胞菌Pseudomonadaceaesp. ST3 兼具固氮、解磷、產吲哚乙酸的能力，大腸桿菌E. coli ND2B 兼具固氮、解無機磷、產吲哚乙酸的能力。通過對這2 株菌進行促生性狀的綜合分析，發現ST3 和ND2B 相比于其他內生菌具有較強的促生性狀。

2.2 蒙脫石及復合菌劑共同接種對田菁生長的影響

在不同程度鹽脅迫下，蒙脫石和復合菌劑均顯表現出了促生和降低鹽脅迫的效果 （圖1）。在NaCl0、100、200 mmol/L 土壤中，單獨施用蒙脫石處理的田菁株高分別較CK 增加了19.28%、39.83%、41.05%，莖稈重分別顯著增加 8.82%、40.57%、11.04% （Plt;0.05）；單獨接種復合菌劑處理株高分別較CK 增加了84.52%、70.07%、84.13%，莖稈重分別增加了 118.18%、154.09%、98.76% （Plt;0.05）；共同接種蒙脫石和復合菌劑處理株高較CK 分別增加了 138.8%、157.2%、187.6%，莖稈重分別增加了217.8%、307.6%、286.9% （Plt;0.05）。外源添加復合菌劑和蒙脫石可以促進植株的生長發育，增加植株地上部生物量，緩解高濃度鹽脅迫對植物的傷害。

不同濃度鹽脅迫下，單施復合菌劑、蒙脫石，以及兩者配施對田菁根長、根表面積和根干重產生不同程度的促進作用（表3 ）。單獨添加蒙脫石NaCl0、100、200 mmol/L 處理的田菁根長分別較對照增加 了12.02%、17.08%、7.40%，根表面積分別增加了 11.04%、6.92%、2.26%，根干重分別增加了12.21%、14.87%、25.97% （Plt;0.05）；單獨添加復合菌劑處理植株根長較CK 分別增加了 44.14%、24.40%、39.91%，根表面積分別增加了 26.20%、25.10%、19.50%，根干重分別增加了52.62%、、28.43%、39.91% （Plt;0.05）；共同添加蒙脫石和菌劑處理植株根長分別較對照增加了52.0%、46.9%、40.7%，根表面積分別增加了 36.5%、31.2%、25.0%，根干重分別顯著增加了60.7%、60.7%、72.8% （Plt;0.05）。共同接種復合菌劑和蒙脫石不僅能促進植物根系的良好發育，同時在較高鹽脅迫下還能降低其對植物的傷害。

2.3 蒙脫石及復合菌劑共同接種對田菁生理生態的影響

葉綠素含量是影響植物光合作用的重要因子，對植物的光合作用有著重要的影響，葉綠素含量是反映田菁生理生態狀況的指標和光合速率參數。同時田菁葉片的凈光合速率受田菁葉片葉綠素含量的影響。如圖2 所示，接種復合菌劑或蒙脫石以及共同接種的植物葉綠素含量高于對照處理，并在所有鹽濃度下達到顯著差異（Plt;0.05）。同時田菁葉片凈光合速率（Pn） 在不同處理下的光響應曲線存在顯著差異。光有效輻射≤200 μmol/（m2·s） 范圍內，Pn 隨著光有效輻射增加而迅速增加，之后Pn 緩慢增加逐漸呈穩定趨勢。

如圖2 所示，單獨添加蒙脫石在NaCl 0、100、200 mmol/L 處理下的葉綠素含量較對照分別增加了36.04%、33.55%、42.80%，凈光合速率分別增加了26.71%、18.97%、17.11% （Plt;0.05）；單獨添加復合菌劑下的葉綠素含量較對照分別增加了63.53%、53.97%、88.00%，凈光合速率分別增加了44.45%、42.40%、37.35% （Plt;0.05）；共同接種復合菌劑和蒙脫石在各鹽濃度下的增加效果最為顯著，葉綠素含量較對照分別增加 88.03%、100.28%、138.00%，凈光合速率分別增加 58.25%、43.72%、40.81% （Plt;0.05）。說明即使在高鹽濃度下，蒙脫石和復合菌劑也能緩解鹽脅迫對植物葉綠素和凈光合速率的不利影響。

丙二醛 （MDA） 是不利環境下脂質過氧化的產物，因此MDA 含量高低可以作為判斷植物在逆境脅迫下的受害程度。如圖3 所示，對照處理田菁MDA含量隨著鹽濃度增大而顯著增加。添加蒙脫石處理田菁MDA 含量在NaCl 0、100、200 mmol/L 處理下較CK 分別降低了 17.03%、21.38%、16.54%；添加復合菌劑分別降低了30.34%、30.43%、24.22%；同時添加蒙脫石和復合菌劑分別降低了 45.84%、39.93%、38.41% （Plt;0.05）。

田菁為了更好地適應鹽脅迫環境會分泌抗氧化酶，如 SOD、 POD、CAT 等。如圖3 所示，單獨添加蒙脫石在NaCl 0、100、200 mmol/L 處理下SOD 活性分別較對照顯著增加了 27.93%、22.49%、59.39%，POD 活性分別增加 23.08%、29.41%、20.83%，CAT 活性分別增加 72.27%、70.23%、53.29% （Plt;0.05）；單獨添加復合菌劑SOD 活性分別增加 45.38%、46.58%、90.11%，POD 活性分別增加57.69%、47.06%、64.58%，CAT 活性分別增加117.88%、147.68%、98.40% （Plt;0.05）；同時添加蒙脫石和復合菌劑各 NaCl 處理下酶活性增加最為顯著，SOD 活性分別增加 111.92%、118.26%、192.11%，POD 活性分別增加 146.15%、138.24%、137.50%，CAT 活性分別顯著增加 191.15%、222.96%、151.50%（Plt;0. 05）。

2.4 蒙脫石及復合菌劑共同接種對土壤理化性質的影響

土壤鹽漬化會影響土壤 pH，從而影響土壤的有效養分供應。在不同鹽脅迫下，復合菌劑和蒙脫石對土壤pH 有緩解作用。如圖4 所示，不接種復合菌劑和蒙脫石的條件下，隨著鹽脅迫程度的增加，土壤 pH 升高，在 100 mmol/L NaCl 脅迫下，土壤 pH為 8.63，在200 mmol/L NaCl 脅迫下，土壤pH 為 8.65；并且土壤pH 在兩個鹽脅迫處理間差異顯著。與對照相比，單獨添加蒙脫石在無鹽處理、100 mmol/LNaCl 處理、200 mmol/L NaCl 處理下pH 分別顯著降低了1.16%、1.04%、1.04%；土壤鹽含量分別顯著降低6.07%、11.03%、16.78%。與對照相比，單獨添加復合菌劑在無鹽處理、100 mmol/L NaCl 處理、200 mmol/L NaCl 處理下pH 分別顯著降低了 1.86%、1.97%、1.97%；土壤鹽含量分別顯著降低 24.29%、28.67%、30.82%。與對照相比，同時添加蒙脫石和復合菌劑在無鹽處理、100 mmol/L NaCl 處理、200mmol/L NaCl 處理下pH 分別顯著降低了 3.60%、3.82%、3.82%；土壤鹽含量分別顯著降低33.60%、36.39%、39.04% （Plt;0.05）。表明復合菌劑和蒙脫石在不同鹽濃度下具有降低土壤 pH、改良鹽漬土的作用。

土壤鹽漬化會影響土壤中速效磷、速效鉀、有機質、全氮含量，從而影響土壤的養分供應。如圖5所示，在不同鹽脅迫下，復合菌劑和蒙脫石對土壤的速效磷、速效鉀、有機質、全氮含量有促進作用。與對照相比，單獨添加蒙脫石在0、100、200 mmol/LNaCl 處理下，速效磷含量分別顯著增加 11.87%、19.82%、19.54%，速效鉀含量分別升高11.11%、12.33%、12.27%，有機質含量分別顯著增加 5.26%、6.03%、9.82%，全氮含量分別升高 16.21%、28.70%、37.31% （Plt;0.05）。 與對照相比，單獨添加微生物菌劑處理速效磷含量分別增加18.49%、26.24%、29.05%，速效鉀含量分別升高 17.80%、16.85%、21.36%，有機質含量分別顯著增加11.57%、11.89%、15.42%; 全氮含量分別升高 36.36%、49.78%、52.22%（Plt;0.05）。與對照相比，同時添加蒙脫石和微生物菌劑速效磷含量分別顯著增加 47.03%、35.40%、37.28%，速效鉀含量分別顯著升高 29.72%、27.53%、30.59%，有機質含量分別顯著增加 26.35%、17.95%、21.85%，全氮分別升高 120.16%、92.83%、87.56%（Plt;0.05）。

3 討論

3.1 蒙脫石和復合菌劑對田菁生長性狀的影響

已經有研究證明，有益細菌和納米材料在鹽脅迫的土壤中配施可以增加植物的生物量[25]。目前已知的鹽漬土下微生物促進植物生長的機制可能包括：產生 1-氨基環丙烷-1-羧酸（ACC） 脫氨酶和吲哚-3-乙酸（IAA），合成磷酸酶和鐵載體，為植物提供可用的營養物質，激活植物的抗氧化系統，清除活性氧（ROS），產生胞外多糖，促進生物膜的形成，并通過結合 Na+介導離子平衡[26]。本研究中，隨著 NaCl濃度從0 增加到 200 mmol/L 時，田菁地上部和地下部生物量降低，可能是因為高濃度鹽脅迫降低了吲哚乙酸和脫氨酶的合成。在本試驗中，同時加入蒙脫石和復合菌劑時田菁地上部和地下部生物量顯著增加，這些結果可能是因為蒙脫石可以直接改善土壤結構、提高土壤肥力[27]，從而影響植物根系對養分的獲取。

3.2 蒙脫石和復合菌劑對田菁生理生態的影響

豆科植物田菁生長在中國黃河三角洲的鹽漬土中，具有高耐鹽性。之前有研究發現，與栽培其他豆科植物相比，田菁根瘤中的根瘤菌數量更多[28]。研究表明，植物生長后期的微生物群落具有更高的微生物多樣性和更多的耐逆境細菌[29]。植物葉綠素含量的變化是植物鹽脅迫的耐受性指標之一，接種復合菌劑或者蒙脫石，以及共同接種蒙脫石和微生物菌劑的植株葉綠素含量顯著增加。這可能是因為接種復合菌劑和蒙脫石后提高了根際中養分和水分利用率[30]。

鹽脅迫會引起活性氧（ROS） 的過量產生，導致如核酸、膜脂質和蛋白質等重要細胞成分的氧化損傷，ROS 代謝在植物對各種非生物脅迫的交叉馴化中起著重要作用[31]。值得注意的是，在高鹽脅迫（100和 200 mmol/L NaCl） 下，共同接種蒙脫石和復合菌劑的田菁植株 POD、SOD、CAT 活性都顯著提高，調節滲透保護劑、清除活性氧積累來保護田菁幼苗，表現為植株丙二醛含量顯著降低，表明共同接種蒙脫石和復合菌劑，有助于提高鹽脅迫下田菁體內相關酶活性，降低細胞膜氧化損傷，這與 Qin等[32]的研究結果一致。

3.3 蒙脫石和復合菌劑對土壤理化性質的影響

細菌對土壤養分轉化和植物生長至關重要，可以降低土壤 pH 、提高堿解氮、速效磷和速效鉀含量[33]。本研究也驗證了這一點，研究發現鹽脅迫下土壤 pH 逐漸升高，但是隨著蒙脫石和菌劑的施入可以降低土壤 pH，并且發現在蒙脫石和復合菌劑的共同施入時土壤中的含鹽量也顯著降低。一方面是因為田菁本身具有較強的耐鹽能力，可以吸收土壤中的鹽離子，并且其根系可以促進土壤鹽分淋溶[34]；另一方面可能是因為微生物菌劑和蒙脫石促進了田菁對鹽離子的吸收。

本研究發現，同時施用蒙脫石和復合菌劑可以顯著增加土壤中速效磷、速效鉀、有機質含量，比單獨施用效果更顯著。有機質含量的增加可能是因為復合菌劑的施加使土壤中微生物活性提升，而土壤微生物活性是有機質形成、轉化和穩定的主要驅動力[35]。施用蒙脫石減少了氮元素的淋溶損失，提高了氮元素含量，在一定范圍內，施用蒙脫石對氮元素的提升效果隨蒙脫石施用量的增加而增強[36]。本試驗中蒙脫石和復合菌劑共同接種對田菁的土壤全碳、全氮含量有促進作用。蒙脫石施入土壤后，能吸水膨張，改變土壤中固、液、氣的比例，使土壤結構疏松，能起到改善土壤理化性質的作用，使土壤既可以保水保肥，又做到不污染土壤環境。

4 結論

在不同鹽濃度下，蒙脫石或復合菌劑均可以不同程度地改善土壤理化性質，促進田菁生長，顯著升高地上部和地下部生物量，葉片的凈光合速率、葉綠素含量和抗氧化酶活性，兩者復配使用可進一步增加田菁的抗鹽脅迫能力，促進其對土壤養分的吸收；顯著降低土壤pH、鹽含量，提高土壤速效磷、速效鉀、有機質、全碳、全氮含量，極大地改善鹽脅迫下土壤的理化性質。綜上，蒙脫石和復合菌劑配施是提高田菁改良鹽漬土效果的可行措施。