化肥有機肥配施比例對油菜根際土壤利用光合同化碳微生物的影響

關鍵詞： 化肥有機肥施用比例； 13C-標記； 光合同化碳； PLFA 含量； 微生物多樣性

油菜是我國重要的油料作物，同時也是一種對氮肥需求高和對氮素缺乏敏感的作物[1]，適合的土壤氮素供應對油菜生長發育和穩產豐產起著不可忽視的作用[2]。然而，在長江流域油菜主產區不合理施肥現象較為普遍[3]，為了追求更高產量過量施用化肥[4?5]，而有機肥施用量急劇下降，我國2010 年有機肥施用量僅占總施肥量的10%[6]。長期過量施用化肥會導致土壤理化性質惡化、土壤退化[7]、土壤整體微生物群落多樣性降低[8]。施用有機肥能夠提高土壤養分含量，改善土壤理化性質，提升土壤微生物活性[9]。在農藥化肥雙減背景下，化肥有機肥配施對于保障糧油安全和環境友好具有重要意義。前人研究發現，化肥有機肥配施能夠改善土壤結構[10]，增加土壤肥力[11]，有利于土壤培肥和作物增產[9]。土壤微生物的變化能夠敏感反映土壤質量變化[12]，微生物群落對作物生長和土壤養分平衡起著調節作用[13]。王逗等[14]發現，長期施用有機肥能夠增加細菌與真菌種群豐度和多樣性，改變土壤養分循環特征。王偉華等[15]采用磷脂脂肪酸法PLFA 對微生物群落進行研究，發現有機肥+化肥配施的土壤真菌、革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的PLFA 值最高，長期化肥配施有機肥能顯著增加土壤養分含量和土壤微生物量，改善微生物群落結構和活性，最終培肥地力，優化土壤微生物結構。

根際是微生物數量和活性最高的區域，是土壤環境最復雜的區域，同時也是微生物與植物的相互作用最強烈的區域[16?17]。宋以玲等[18]發現，在化肥減量10%～30% 下，配施等量有機肥增加了根際土壤細菌和放線菌數量，顯著降低了真菌數量，同時提高了根際土壤中有效養分和有機質含量。根系分泌物是根系釋放到根際環境中的有機物質和一些無機離子的總稱，能夠為根際微生物提供豐富的營養物質和能源，驅動著根際的微生物過程[19]。植物光合同化碳以根際沉積物的形式進入土壤，是根際微生物的主要碳源和能量來源，自然條件下，通過根系分泌物向地下輸送有機化合物的量約占凈光合同化碳的17%[20]。根際微生物對光合同化碳的利用能夠顯著影響土壤碳固定過程，研究化肥有機肥不同配比對根際微生物利用光合同化碳的影響，對于進一步了解根際土壤碳循環和碳固定過程具有重要意義。

研究表明，合理的有機肥配比會促進有機質的積累和根際微生物的活動，進一步影響其對光合同化碳的利用能力，從而提高土壤的碳固定能力[17]。一些微生物可能利用有機肥中的氮素來代謝光合同化碳，從而影響土壤中的氮素循環和生物固氮過程。這對于推動農業生產和土壤健康的可持續發展至關重要。近期發展起來的穩定性同位素探針技術SIP，能夠定量研究參與光合同化碳轉化的微生物群落，13C-PLFA 以其操作簡單、能快速處理大量樣品、靈敏度高等特點，被廣泛用于利用光合同化碳微生物的研究[21]。

前人對化肥有機肥配施對土壤微生物結構的影響已經做了大量研究，本研究利用13C 標記磷脂脂肪酸法（13C-PLFA），探究不同化肥有機肥配施對油菜根際土壤利用光合同化碳微生物多樣性的影響，解析影響利用光合沉積碳土壤微生物群落分布的主要環境因素，這對指導科學施肥，調控土壤微生物群落健康，保證油菜種植的可持續發展和地力提升具有重要的經濟意義與研究意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤于2017 年從中國科學院桃源農業生態試驗站（111°26′E，28°55′N，海拔92.2 m） 旱地采集，為亞熱帶第四紀紅色黏土發育的典型紅壤，其0—20 cm 土層基本理化性質為：pH 4.55、有機質13.8 g/kg、全氮0.84 g/kg、全磷0.38 g/kg、全鉀12.3 g/kg、堿解氮77.8 mg/kg、有效磷6.05 mg/kg、速效鉀103 mg/kg[14]。

盆栽試驗于2017 年11 月24 日 至2018 年1月2 1 日，在中國科學院亞熱帶農業生態研究所（118°05′E，28°12′N） 溫室進行，供試作物為油菜（ Brassica napus L.），品種為湘雜油6 號。

1.2 化肥有機肥配比試驗

共設置化肥與有機肥5 個配比處理，各處理按照等氮、磷、鉀量原則，以純氮量折算有機肥用量，再計算有機肥中帶入的磷和鉀量，不足部分由化肥補齊。依據有機肥在總氮投入中的占比 0%、25%、50%、75%、100%，依次記為CK、OF25、OF50、OF75、OF100，每個處理4 次重復。供試化肥包括尿素、過磷酸鈣（P2O5） 和氯化鉀（K2O ），有機肥采用經過發酵處理后自然風干的牛糞，其養分含量為N 1.09 g/kg、P2O5 4.39 g/kg、K2O 18.46 g/kg。

1.2.1 植株栽培 盆栽試驗采用高20 cm、直徑16 cm 的PVC 管制作而成的根箱裝置[14]，將田間采集的土壤去除植物殘留和雜質后過2 mm 篩，風干后與不同配比的化肥有機肥混合均勻，使土壤中肥料含量最終達到N 200 mg/kg、P2O5 130 mg/kg、K2O200 mg/kg；將混勻土壤裝入種植盆中，每盆土樣3.5 kg。調節土壤含水量至土壤田間含水量的75%，然后移栽3 株長勢一致的2 周齡油菜幼苗。

1.3 樣品采集與測定

1.3.1 同位素標記 13CO2 脈沖標記工作于油菜移栽40 天后蕾苔期進行，將直徑15 cm、高60 cm 的有機玻璃罩置于盆栽上，每天11：00—16：00 用注射器向盆中注射高純13CO2，每1 h 充1 次，每次充0.1 L，每天充5 次，連續標記20 天。油菜施肥、移栽60天后破壞性采集根際土壤，經液氮速凍后于?80℃ 冷凍保存，研磨過2 mm 篩，于Teflon 管中保存。

1.3.2 磷脂脂肪酸PLFA 提取與測定 微生物群落結構用土壤磷脂脂肪酸phospholipid fatty acid（PLFA） 表示，通過確定不同樣品中PLFA 的種類與豐度，推斷出微生物群落組成的變化與差異。PLFA的提取分為三步：提取、純化與衍生化。使用溶劑氯仿―甲醇從土壤樣品中提取PLFA，隨后用固相萃取法去除可能干擾分析的雜質和其他脂質化合物，將純化的 PLFA 衍生化，將其轉化為適合氣相色譜（GC） 分析的揮發性化合物，隨后采用氣相色譜儀測定，根據化學性質分離各個脂肪酸甲酯[ 2 2 ]。PLFA的13C 值測定采用氣相色譜?燃燒?同位素比率質譜聯用儀（系統包括DeltaV 同位素比值質譜儀，氣相色譜儀單四級桿質譜儀，配備NIST11 譜庫） 測定；在標記組和對照組均能測到1 3C 值的PLFA 單體共有15 種，包括12 種細菌：14：0、16：0、15：0、18：0、19：0、20：0、17：0、a15：0、i17：0、2OH 14：0、3OH14：0、cy17：0，其中a15： 0、i17： 0 為革蘭氏陽性菌（G+），2OH 14：0、3OH 14：0、cy17： 0 為革蘭氏陰性菌（G?），3 種真菌：18：1w9tans、18：2w6c、18：1w9c。根據脂肪酸分子碳鏈長度、雙鍵位置和官能團等信息進一步分析15 種微生物群落PLFAs 結構特征，得到5 類脂肪酸，分別是直鏈飽和脂肪酸（SATFA）、支鏈飽和脂肪酸（ B R F A ） 、單鍵不飽和脂肪酸（MUFA）、羥基脂肪酸（OHFA） 和多鍵不飽和脂肪酸（PUFA），分別分析其相對豐度，計算其絕對數量。以15 種PLFA 單體的數量總和表示總微生物生物量。

1.3.3 土壤理化性質測定 土壤有機碳采用硫酸?重鉻酸鉀外加熱容量法測定；土壤全氮采用濃硫酸和催化劑消解—AA3 流動分析儀測定；土壤全鉀采用硝酸、氫氟酸和高氯酸消解—火焰型原子吸收儀法測定；土壤全磷采用濃硫酸和高氯酸消煮—AA3 流動分析儀測定；土壤堿解氮采用堿解擴散法測定。

1.3.4 根系分泌物的提取與測定 根系分泌物收集采用離位溶液培養法，再用氨基酸自動分析儀日立L8900 測定氨基酸總量；通過高效液相色譜法HPLC檢測根際土壤有機酸的總量。

1.4 數據處理

試驗數據采用Excel 2010 進行初步處理和圖表繪制，應用SPSS 25.0 進行方差分析和相關分析，通過Canoco5 進行主成分分析、冗余分析和方差分解，利用Origin 9 繪制柱狀圖。

微生物多樣性分析采用Shannon-Wiener 多樣性指數（H）、Simpson 優勢度指數（D） 方法[23]。

Shannon-Wiener 多樣性指數（H），計算公式為：

2 結果與分析

2.1 化肥有機肥配施對油菜根際土壤理化性狀的影響

由表1 可知，隨著有機肥配施比例的增加，土壤有機碳含量顯著增加；其中全施有機肥（OF100）土壤有機碳含量顯著高于其他各處理，較CK、OF25、OF50、OF75 分別增加了55.82%、56.90%、27.57%、30.62%；土壤全氮含量隨有機肥配施比例增加同樣也顯著增加，其中OF100 處理全氮含量顯著高于其他各處理，為1.47 g/kg；根系分泌氨基酸量隨著有機肥配施比例的增加也顯著增加，其中OF75 處理氨基酸含量顯著高于其他處理，為8294 μg；同時C/N 的值隨著有機肥配施比例的增加而增加。土壤全鉀和全磷隨有機肥配施比例增加多未表現出顯著差異，而土壤堿解氮含量隨著有機肥配施比例增加呈現出顯著下降的趨勢；其中OF75、OF100 較CK 顯著降低，分別為176 和177 mg/kg，分別下降了36.47% 和36.3%。

2.2 化肥有機肥配施對油菜根際土壤利用光合同化碳微生物組成的影響

油菜根際土壤中，利用光合同化碳的微生物特征性PLFA 量平均占微生物特征性PLFA 總量的2.16%，其中13C-細菌和13C-真菌特征性PLFA 含量分別占根際總細菌和總真菌特征性P L F A 含量的1.47% 和4.07%；利用光合同化碳的革蘭氏陽性菌（13C-G+） 和革蘭氏陰性菌（13C-G?） 特征性PLFA 含量平均占根際總G +菌和G ?菌特征性P L FA 含量的2.46% 和1.23%。與CK 相比，OF75、OF100 處理13C-真菌占比顯著降低，OF75 顯著降低了13C-細菌、13C-G+和13C-G?的特征性PLFA 含量占比，四個有機肥配施處理均顯著降低了13C-G?的特征性PLFA 占比（圖1）。

隨著有機肥比例從CK 處理增加到OF100 處理，根際利用光合同化碳的細菌和真菌，革蘭氏陽性菌（G+） 和革蘭氏陰性菌G?以及微生物PLFA 總量均呈現先降低后增加的趨勢（圖2）。與CK 相比，OF75、OF100 處理根際土壤利用光合同化碳G?菌分別增加了36.41% 和62.03%，總微生物1 3C-PLFA量，以及細菌、真菌和G+菌13C-PLFA 量與CK 沒有顯著差異。隨著有機肥比例的增加（從OF25 處理到OF100 處理），細菌/真菌值增加，而G+菌/ G?菌值減少。與CK 相比，OF75 和OF100 細菌/真菌值分別增加了59.21% 和59.31%，G+菌/G?菌值分別減少了35.07% 和34.45% （表2）。

主成分分析（PCA） 表明，與油菜根際總微生物群落分布一致，化肥有機肥配施顯著影響油菜根際利用光合同化碳微生物群落結構分布，主成分1和主成分2 中的主要因素分別為i17：0、18：1w9c，和14：00、18：1w9c，它們分別解釋了71.85% 和16.91% 群落分布變異（圖3）。不同施肥處理油菜根際利用光合同化碳的微生物群落的分布出現了明顯的空間距離，OF25 和OF100 處理相距較近，CK、OF50、OF75 相距較近，表明OF25 和OF100 的微生物群落組成接近，CK、OF50、OF75 處理的微生物結構接近，與OF25、OF100 的差異較大。

2.3 不同施肥處理對油菜根際土壤利用光合同化＼碳微生物多樣性的影響

由圖4 可以看出，OF25 處理利用光合同化碳的微生物多樣性高于總微生物多樣性，CK、OF50、OF75 處理相似，OF100 處理二者之間無明顯差異。與對照相比，OF25 處理顯著降低了油菜根際土壤總微生物多樣性與利用光合同化碳微生物多樣性，OF100 處理顯著提高了總微生物多樣性，OF50、OF75 處理對總微生物和利用光合同化碳微生物多樣性無顯著影響。

由圖5 可見，真菌和G+菌是利用光合同化碳的主要群落，與總微生物群落相比，利用光合同化碳真菌和G+菌相對豐度較高。但隨著有機肥替代化肥比例增加，細菌相對豐度增加，真菌相對豐度減少；G?菌相對豐度增加，G+菌相對豐度減少。

2.4 影響油菜根際土壤利用光合同化碳微生物群落分布和多樣性的環境因子

冗余分析（RDA） 表明土壤有機碳、全氮、氨基酸總量、堿解氮是影響油菜根際土壤總微生物群落和利用光合同化碳微生物群落分布的關鍵環境因子（圖6）。總微生物群落RDA1 軸的解釋度為63.72%，RDA2 軸解釋度為14.41%，共同解釋了微生物群落變化的78.13%；利用光合同化碳微生物群落RDA1軸的解釋度為66.95%，RDA2 軸解釋度為15.53%，共同解釋了微生物群落變化的82.48%。

相關性分析結果見表3，解釋比例和貢獻率越高，說明該因素與土壤微生物多樣性相關性越顯著。油菜根際土壤總微生物和利用光合同化碳的微生物多樣性Shannon-Wiener 指數與全氮和有機碳均極顯著正相關，氨基酸總量僅與利用光合同化碳的微生物多樣性顯著正相關。

3 討論

3.1 根際土壤微生物群落對外來碳源的利用

本研究發現，真菌和G+菌是油菜根際利用光合沉積碳的主要微生物群落。Treonis 等[24]在野外條件得出了一致的結論，即植物光合同化物主要是被革蘭氏陽性菌和真菌利用。而Tian 等[25]的研究發現革蘭氏陰性菌和真菌是在非淹水和干濕交替狀態下利用水稻光合同化碳的主要微生物群落。Johnson等[26]利用13C-CO2 標記技術發現叢枝真菌能在短時間內轉化利用草地植物光合同化碳，這可能是因為真菌能夠利用菌絲吸收到更多的光合碳源。本研究還發現，隨著有機肥替代化肥比例的增加，細菌/真菌值增加，而G+菌/ G?菌值減少，說明細菌，尤其是G?菌更偏好有機肥含量高的土壤，這與G?菌更易在富營養的環境中生長特性相一致[27?28]。與細菌相比，真菌對環境的耐受力更強[16]，類似地，G+菌也比G?菌更容易在寡營養的環境生長，有趣的是，本研究證實真菌和G+菌是利用光合沉積碳的主要微生物群落。本研究首次發現與外源直接投入有機碳相比，寡營養生長策略微生物更偏好利用通過光合沉積碳。

3.2 有機肥替代化肥對根際微生物群落利用光合同化碳的影響

本研究發現，隨著有機肥替代化肥比例增加，油菜根際土壤總微生物以及利用光合同化碳微生物的特征性PLFA 含量和多樣性呈現先降低后增加的趨勢，當化肥有機肥配施比例達到1∶3，油菜根際土壤微生物特征性PLFA 含量和多樣性明顯優于單施化肥。王逗等[14]研究也發現，化肥有機肥1∶3 配比為油菜生長提供最均衡養分。土壤全氮和有機碳含量是影響油菜根際土壤微生物多樣性的主要環境因子，隨著有機肥配比增加，土壤有機碳含量增加，一方面是由于有機肥本身含有大量有機碳直接外源添加進入土壤[29]，另一方面有機肥促進了根際土壤微生物的繁殖生長，有利于外源添加碳轉化為土壤有機碳，最終提高土壤有機碳含量[30?31]。本研究進一步發現化肥有機肥1∶3 配比能夠為根際土壤微生物提供更友好的微生態環境，可以作為油菜綠色施肥管理推薦方案。

本研究還發現，根系分泌氨基酸量顯著影響油菜根際土壤利用光合同化碳的微生物群落組成，氨基酸量與油菜根際土壤利用光合同化碳微生物多樣性指數顯著正相關。Wang 等[ 3 2 ]和Ge 等[ 3 3 ]研究發現，氮肥施用增加的根部光合碳沉積量是促使PLFA的13C 標記量增加的主因[34]。氨基酸作為重要的營養來源，促進土壤微生物生長與繁殖[35]，而微生物的代謝產物又反作用于植物根系對氨基酸的分泌[36]。本研究發現，除了土壤有機碳、全氮、堿解氮等理化因子，根系分泌氨基酸量也顯著影響油菜根際土壤利用光合同化碳的微生物群落組成和多樣性，甚至發揮更重要的作用。

本研究發現處理的聚集情況并不如我們一開始所想的那樣，隨著有機肥的增加而有規律的聚集在一起，而是OF75、CK 與OF50 聚集在一起，OF25 和OF100 分別聚類。雷菲等[ 3 7 ]的研究也發現類似的現象，部分細菌的相對豐度隨著有機肥用量的增加呈先上升后下降的趨勢。我們的研究也發現隨著有機肥的增加，部分真菌的相對豐度先上升再下降，這可能與其具有降解土壤中可溶性有機底物的功能有關[38?39]，有機肥用量增加會創造良好的土壤環境[40?41]，使其更好的進行生長與繁殖[42]，但當有機肥施用比例超過80% 時，土壤中堿解氮含量減少，可提供其快速繁殖所需的氮源減少，因此相對豐度有輕微的下降趨勢[ 4 3 ]。這可能也就解釋了為什么OF100 并沒有像我們所預料的那樣與其他處理有規律的聚集在一起。

4 結論

有機肥替代化肥比例超過75% 后，有機肥對油菜根際土壤中利用光合同化碳的微生物PLFA 量的影響顯著不同于低有機肥替代比例，高有機肥替代比例顯著增加了利用光合碳微生物PLFA 量，但減少了其占總微生物量的比例。油菜根際土壤利用光合同化碳的微生物以真菌和G+細菌為主，有機肥施用促進根系氨基酸分泌，進而增加了利用光合同化碳的微生物多樣性。總而言之，化肥有機肥1∶3 配比作為油菜綠色施肥管理推薦方案，能夠為根際土壤微生物提供更友好的微生態環境。