基于網絡藥理學探究柴胡桂枝湯治療膽管癌的作用機制

劉鑫禹 張東偉

*基金項目：2019全國中醫臨床特色技術傳承骨干人才培訓項目（國中醫藥人教函［2019］36號）

第一作者簡介：劉鑫禹（1999-），女，碩士研究生，研究方向：中西醫結合防治惡性腫瘤。

△通信作者：張東偉，E-mail：zdw138667@163.com

摘要：目的? 基于網絡藥理學探究柴胡桂枝湯治療膽管癌的主要活性成分及潛在的作用機制。方法? 利用TCMSP數據庫篩選出柴胡桂枝湯中的有效成分及對應的靶點蛋白，與Uniprot數據庫中人類基因名稱匹配后對作用靶點規范化處理；基于Genecard、Disgenet等數據庫篩選出膽管癌疾病靶點，并與中藥靶點蛋白匹配得到共同靶點；將共同靶點信息導入String數據平臺進行PPI網絡分析，并通過Metascape數據平臺完成GO功能注釋和KEGG富集。結果? 獲取柴胡桂枝湯治療膽管癌的96個有效靶點，其中核心靶點8個。GO注釋共得出1784條目，KEGG富集通路為179條。結論? 柴胡桂枝湯可能通過各種癌癥信號通路、內分泌抵抗、EGFR TKI耐藥性、鉑耐藥性、IL-17信號通路、p53信號通路等途徑發揮治療作用，為膽管癌的診治提供了參考依據。

關鍵詞：柴胡桂枝湯；膽管癌；網絡藥理學；作用機制

中圖分類號：R730.5??? 文獻標志碼：A??? 文章編號：1007-2349（2024）05-0067-06

膽管癌（cholangiocarcinoma，CC）是一種源自膽管上皮的惡性腫瘤，發病率在世界范圍內逐年上升［1］，是世界上第二大常見的肝臟系統惡性腫瘤，僅次于肝細胞性肝癌。約40%～70% 發生在肝外膽管，5%～20%的CC發生在肝臟內［2］。其發病隱匿，所有病例在40歲之前很少被診斷出來，男性較女性多見［3］。CC的發生與原發性硬化性膽管炎、肝硬化、非酒精性脂肪性肝病、膽管結石、HBV/HCV感染以及肝吸蟲病等密切相關［4］。作為一種惡性侵襲性疾病，膽管癌更易向膽管壁浸潤并侵犯周圍肝組織、周圍血管、神經及淋巴，手術切除率低［5］，且對化療敏感性差，保守治療的效果也不夠理想，預后不佳。統計結果顯示，其5年生存率低于23.7%，存活率一般<2年［6］。

膽管癌在中醫古籍中無明確病名，多分散于“積聚”、“脅痛”、“黃疸”等門類中。《靈樞·脹論》曰：“膽脹者，脅下脹痛”。中醫學認為膽為“中精之腑”，與肝相表里，主儲膽汁而傳化水谷與糟粕，以通降下行為順。凡外感濕邪、情志不舒、飲食失節或蟲積等，均可導致肝失條達，氣機不暢，運化樞機不利，氣血停滯郁于脅下，久而化瘀；肝木乘土，脾氣不足，無力推動津液輸布，水液停聚，久而伏熱醞釀生痰，痰熱與瘀血相搏，積于膽腑，發為此病［7］。柴胡桂枝湯（CHGZD）源自《傷寒雜病論》，由小柴胡湯和桂枝湯各半合方而成，主要組成包括柴胡、桂枝、黃芩、白芍、人參、半夏、甘草、生姜、大棗。現臨床上人參多用太子參代替。方中柴胡與桂枝相伍，條達肝氣、宣通發散，使清陽上升；黃芩、半夏苦降直折，疏肝降逆，氣機調暢則脈道通利，津液得泄，瘀血頑痰則有出處；芍藥斂陰柔肝，平肝木、清虛火，桂芍相伍又可調和營衛，溫通脈絡，引血歸經；參、姜、草、棗建中補虛，使氣血生化有源。酸甘化陰、辛甘化陽，陰陽同補，生生不息。全方散中有收、補中有瀉、降中有升，寒熱平調，使陰陽相生，氣血調和，氣機升降有常，正氣得復則邪自去。長期以來，柴胡桂枝湯在肝膽系統腫瘤的治療中療效確切，但對其治療膽管癌的作用機理尚無系統性研究。本研究在此基礎上，應用網絡藥理學理論，聚焦柴胡桂枝湯在膽管癌中的治療作用，探索中醫復方中的有效成分、關鍵信號通路及靶點，構建相關網絡，分析其治療膽管癌可能的作用機制，為后期的臨床研究提供一定的理論基礎。

1? 資料與方法

1.1? CHDZD有效成分篩選? 利用中藥系統藥理學分析平臺數據庫（TCMSP，https：//tcmsp-e.com/）分別搜索柴胡、桂枝、黃芩、太子參、甘草、半夏、白芍、生姜、大棗的主要化學成分。以口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18作為篩選標準，最終得到193個有高度活性的關鍵化合物成分。

1.2? 中藥靶點預測及生物活性成分-靶點網絡構建? 繼續以TCMSP為平臺，查找193個關鍵化合物對應的蛋白靶點，再使用Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/）查詢人類基因名稱并與之匹配，得到CHGZD的潛在作用靶點。利用網絡繪圖軟件Cytoscape 3.7.1［8］構建CHGZD主要生物活性成分-靶點之間的作用網絡。

1.3? 膽管癌靶點篩選? 在Genecards（https：//www.genecards.org/）、Disgenet（https：//www.disgenet.org/）、TTD（https：//db.idrblab.net/）、OMIM（https：//omim.org/）、Uniprot疾病基因數據庫中分別以“Cholangiocarcinoma”為關鍵詞檢索膽管癌的疾病作用靶點，整合所有數據庫搜索到的信息，刪除重復項后最終得到靶點1833個。

1.4? PPI網絡構建? 將藥物靶點與疾病靶點導入Venny2.1.0［9］，繪制CHGZD-CC交集基因的韋恩圖，得到交集基因96個。通過蛋白質互作網絡分析數據平臺String（https：//cn.string-db.org/）對交集基因進行互作分析，以相互作用評分≥0.700為篩選條件，構建CHGZD治療CC的PPI網絡圖。將PPI網絡數據導入Cytoscape 3.7.1，以度值（degree）、介數中心性（Betweenness Centrality，BC）、親近中心性（Closeness Centrality，CC）作為標準，三輪中位數篩選后得到核心靶點8個。

1.5? GO富集和KEGG通路富集? 為了進一步分析CHGZD作用于CC的生物學過程和信號通路傳導過程，將網絡中的靶點導入基因富集分析平臺Metascape（https：//metascape.org/），進行GO富集和KEGG通路富集。取P<0.01且排名前10的GO條目構圖并對比分析。基于富集分數（Enrichment Score，ES）排名前20的GO條目和信號通路分別繪制氣泡圖、條形圖。

2? 結果

2.1? CHGZD有效成分篩選? 基于TCMSP數據平臺分別檢索CHGZD中九種中藥的成分信息，分別篩選出柴胡成分17項，桂枝成分8項，黃芩成分36項，白芍成分13項，半夏成分13項，太子參成分8項，生姜成分5項，大棗成分29項，甘草成分92項，去重后得到193種化合物。有效成分詳見圖1。

2.2? 有效成分靶點預測及生物活性成分-靶點網絡構建? 通過TCMSP數據庫繼續檢索193種有效成分相對應的靶點蛋白信息。在Uniprot數據庫中檢索人類基因名稱及其對應蛋白，匹配后得到CHGZD有效成分可能的作用靶點共278個。利用Cytoscape 3.7.1制作生物活性成分靶點之間的作用網絡圖，共獲得2403對生物活性成分與對應作用靶點，見圖2。圖中節點尺寸越大/透明度越低表明度值（degree）越大。槲皮素、山奈酚、木犀草素、漢黃芩素、β-谷甾醇等化合物能與多個靶點結合發揮作用，見表1。PPARG、TOP2A、PTGS2、MAPK14等靶點能與多個成分形成作用關系。

2.3? CC靶點篩選及藥物-疾病靶點交集? 在多個疾病基因數據庫中搜索CC相關靶點信息，最后得出Uniprot 10項、Disgenet 877項、TTD 14項、OMIM 23項、Genecards 1186項（篩選分1.5）。去重后的CC疾病靶點共1833個。將藥物靶點與疾病靶點相匹配，最終得出交集基因96個。使用韋恩圖表示結果，見圖3。

2.4? PPI網絡構建? 將交集基因導入String平臺，以相互作用評分≥0.700篩選，刪除無連接節點后，共得出93個節點，794條邊，平均節點度值為16.5。見圖4。其中節點對應各基因靶點，邊對應兩靶點間存在的相互作用關系。將后臺數據導出至Cytoscape 3.7.1，基于degree、BC、CC排序，各用中位數篩選3次，最終以degree≥32.5，BC≥247.89，CC≥0.5878為標準，得到核心靶點8個：TP53、STAT3、AKT1、CASP3、JUN、HSP90AA1、EGFR、MAPK3。

2.5? GO分析和KEGG富集結果? 對96個交集基因進行GO及KEGG富集分析，共得出GO條目1784項，KEGG富集通路179條。GO分析中包括：生物學過程（biological process，BP）1594項，細胞組分（cellular component，CC）70項，分子功能（molecular function，MF）120項。GOBP、GOCC、GOMF各選取P值排名前10項信息繪制條狀圖，見圖6。分析可知潛在作用靶點的生物學過程主要涉及對激素反應、對異物刺激反應、對活性氧反應、對氧氣水平反應、對細胞群增殖的負向調節等；細胞組分主要涉及轉錄調節器復合物、膜筏、囊泡腔、膜微域、細胞質囊泡腔等；分子功能主要涉及轉錄因子結合、激酶結合、泛素類蛋白連接酶結合、蛋白激酶活性、信號受體調節器活性等。根據富集指數（ES）排名取前20項繪制氣泡圖，見圖7。KEGG富集主要涉及的通路包括各種癌癥信號通路、內分泌抵抗、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、鉑類藥物耐藥性、IL-17信號通路、p53信號通路、催乳素信號通路、多種類細胞凋亡信號通路等，見圖8。

3? 討論

目前膽管癌的治療仍以手術為主，同步放化療在晚期不可切除的膽管癌治療中也有一定獲益［10］。對于CC的發病機制仍在不斷深入探索中，分子靶向治療近年來也取得了重大突破，但由于其高度分子多樣性和基因異質性的特征，個體差異較大，對臨床指導有一定局限性。免疫治療前景廣闊，單藥治療的安全性和有效性已得到初步驗證，但在臨床實踐中療效往往不達預期。

對于膽管癌的治療，中醫多責之肝失疏泄，中焦樞轉不利，有形之邪郁積膽腑。治宜疏肝和營，通利膽腑，同時注意顧護正氣，健脾和胃，益氣養血，以期祛邪而不傷正。柴胡桂枝湯作為經方，臨床常作為膽管癌治療的底方加減，現廣泛應用于惡性腫瘤及其并發癥的治療中。方雨瀟等［11］發現CHGZD聯合卡培他濱可能通過抑制IL-6/STAT3信號通路誘導細胞凋亡，抑制三陰性乳腺癌裸鼠體內腫瘤的生長。江恒等［12］以CHGZD聯合鹽酸羥考酮緩釋片治療癌痛，結果顯示爆發痛及不良反應發生率顯著降低。

本研究通過網絡藥理學理論探索柴胡桂枝湯治療膽管癌的潛在作用機制。對柴胡、桂枝、黃芩、白芍等九味藥物有效成分進行篩查，最終得出柴胡桂枝湯的關鍵有效成分5種：槲皮素、山奈酚、木犀草素、漢黃芩素、β-谷甾醇。槲皮素是一種乙酰膽堿酯酶抑制劑，可通過抗氧化、抑制細胞增殖、促進細胞凋亡、調節炎癥反應等發揮抗腫瘤作用，一般在肺、肝、腎和小腸中積累［13］。近期研究發現槲皮素能夠通過抑制膽管癌細胞的上皮間充質轉化過程逆轉細胞毒性抗腫瘤藥物的耐藥性［14］，上調其對癌細胞的殺傷作用。山奈酚存在于多種姜科植物、蔬菜及茶類中，具有抗氧化、抑制T細胞過度活化、抗腫瘤、抗炎等作用［15］，還可通過抑制PI3K/AKT/GSK-3β信號通路，下調P13K、AKT磷酸化水平，從而誘導細胞凋亡［16］。木犀草素為黃酮類化合物，可通過抗血管生成、抗炎效應等發揮抑癌作用。漢黃芩素、β-谷甾醇亦被證實具有抗氧化、抗炎等活性［17］。對柴胡桂枝湯和膽管癌的96個交集基因進行PPI網絡分析最終得到8個核心靶點，分別是TP53、STAT3、AKT1、CASP3、JUN、HSP90AA1、EGFR、MAPK3，主要參與細胞周期調節、炎癥反應、免疫應答、細胞凋亡等過程。

KEGG富集結果表明，各種癌癥信號通路、內分泌抵抗、EGFR TKI耐藥性、鉑耐藥性、IL-17信號通路、p53信號通路可能是柴胡桂枝湯治療膽管癌的主要作用途徑。EGFR是一種酪氨酸激酶，可參與調節細胞的平衡，刺激腫瘤生長。EGFR基因突變和蛋白過表達，都會激活下游途徑，與肺癌關系密切［18］。酪氨酸激酶抑制劑（TKI）在臨床應用廣泛，但其耐藥情況也變得更加常見，常見的突變機制包括T790M、c-Met、HGF、K-RAS突變、PTEN缺失等［19］。鉑類藥物如順鉑、卡鉑和奧沙利鉑廣泛用于惡性腫瘤的治療中，有研究表明［20］，鉑耐藥性可能源于藥物流入減少/流出增加、谷胱甘肽等細胞內排毒、DNA修復增加、錯配修復減少、細胞凋亡缺陷和腫瘤基因表達的改變。白細胞介素17（IL-17）家族是由IL-17A-F組成的細胞因子子集，在急性和慢性炎癥反應中都起著關鍵作用［21］。IL-17驅動的代謝途徑為組織穩態傳遞重要信號。IL-17 通過不同的 TRAF 蛋白激活下游信號通路，如 IκBζ、NF-κB、C/EBP 和 MAPK 通路等，以誘導細胞的增殖、分化或凋亡［22］。IL-17在肝內膽管癌中的表達已得到證實［23］，IL-17RA可直接作用于腫瘤細胞以誘導炎癥反應。p53蛋白被用作p53調節基因的轉錄激活劑，可被DNA損傷、氧化應激和激活的致癌基因等多種應激信號誘導激活［24］，同時作為上游激活劑，p53蛋白通過激活多種信號通路并與之相互作用來發揮其生長抑制活性。主要參與細胞周期停滯、細胞衰老或凋亡。目前有研究表明［25］，p53可通過誘導 microRNA 34a下調 PD-L1表達，從而在免疫檢查點調節中發揮作用。

綜上，本研究發現柴胡桂枝湯在膽管癌的治療中具有多成分、多靶點、多途徑的作用優勢。柴胡桂枝湯主要通過槲皮素、山奈酚、木犀草素等有效成分發揮調節細胞周期、誘導腫瘤細胞凋亡、抗炎癥等作用，參與各種癌癥信號通路、p53信號通路、IL-17信號通路等，以及對鉑類藥物、EGFR-TKI耐藥性的調控達到治療目的。本研究通過網絡藥理學理論對柴胡桂枝湯治療膽管癌的作用機制進行了初步探討，后續有待體外試驗和臨床研究進一步揭示其原理，為膽管癌協同診治提供更大的參考價值。

參考文獻：

［1］Saha SK，Zhu AX，Fuchs CS，et al.Forty-year trends in cholangiocarcinoma incidence in the U.S.：Intrahepatic disease on the rise［J］.Oncologist，2016，21（5）：594-599.

［2］Sirica A E.Cholangiocarcinoma：Molecular targeting strategies for chemoprevention and Therapy［J］.Hepatology，2004，41（1）：5-15.

［3］Marcano-Bonilla L，Mohamed E A，Mounajjed T，et al. Biliary tract cancers：Epidemiology，molecular pathogenesis and genetic risk Associations［Z］.AME Publishing Company，2016：61-61（2016）.

［4］Choi J，Ghoz HM，Peeraphatdit T，et al.Aspirin use and the risk of Cholangiocarcinoma［J］.Hepatology，2016，64（3）：785-796.

［5］張文杰，孫倍成.膽管癌的治療進展［J］.肝膽胰外科雜志，2020，32（6）：326-330.

［6］Wang Y，Yang H，Shen C，et al.Surgical procedure and longterm survival of hilar cholangiocarcinoma［J］.Int J Clin Exp Med，2015，8（1）：1122-1128.

［7］趙治龍，耿耘.中醫治療膽管癌的探討［J］.中華中醫藥學刊，2014，32（2）：262-263.

［8］Shannon P.et al.，Cytoscape：a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks.Genome Res（2003）11：2498-2504.

［9］Oliveros，J.C.（2007-2015）Venny.An interactive tool for comparing lists with Venns diagrams.https：//bioinfogp. cnb. csic.es/tools/venny/index.html.

［10］Hammad A Y，Berger N G，Eastwood D，et al.Is Radiotherapy Warranted Following Intrahepatic Cholangiocarcinoma Resection？ The Impact of Surgical Margins and Lymph Node Status on Survival［Z］.Springer Science and Business Media LLC，2016：912-920（2016）.

［11］方雨瀟，王淑美，楊倩，等.柴胡桂枝湯加減方聯合卡培他濱抑制三陰性乳腺癌裸鼠皮下移植瘤的生長：基于抑制IL-6/STAT3信號通路［J］.南方醫科大學學報，2022，42（6）：905-912.

［12］江恒，原薇薇，廖皓，等.柴胡桂枝湯聯合鹽酸羥考酮緩釋片治療癌性疼痛的臨床療效觀察［J］.現代腫瘤醫學，2020，28（14）：2517-2519.

［13］Batiha G E-S，Beshbishy A M，Ikram M，et al.The Pharmacological Activity，Biochemical Properties，and Pharmacokinetics of the Major Natural Polyphenolic Flavonoid：Quercetin［J］.Foods，2020，9（3）：374.

［14］王艷麗，唐滋貴.槲皮素抑制膽管細胞癌HCCC-9810細胞上皮-間質轉化并上調抗腫瘤藥物對其殺傷作用［J］.科學技術與工程，2017，17（19）：108-111.

［15］慕靜靜，曾耀英，黃秀艷，等.山奈酚對小鼠T淋巴細胞體外活化、增殖和細胞周期的影響［J］.細胞與分子免疫學雜志，2009，25（12）：1106-1108+1111.

［16］趙明智，張磊，周丹，等.山奈酚調控PI3K/AKT/GSK-3β信號通路促進人炎性乳腺癌SUM190細胞株凋亡的研究［J］.廣西醫科大學學報，2019，36（6）：872-877.

［17］Zheng Z，Zhu W，Lei L，et al.<；p>；Wogonin Ameliorates Renal Inflammation and Fibrosis by Inhibiting NF-κB and TGF-β1/Smad3 Signaling Pathways in Diabetic Nephropa-thy<；/P>；［Z］.Informa UK Limited，2020：4135-4148（2020）.

［18］Huang L，Fu L.Mechanisms of resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors［J］.Acta Pharmaceutica Sinica B，2015，5（5）：390-401.

［19］Ahsan A.Mechanisms of Resistance to EGFR Tyrosine Kinase Inhibitors and Therapeutic Approaches：An Update［M］.Cham：Springer International Publishing，2015：137-153.

［20］Zhou J，Kang Y，Chen L，et al.The Drug-Resistance Mechanisms of Five Platinum-Based Antitumor Agents［J］.Frontiers in Pharmacology，2020，11.

［21］Song X，Qian Y.IL-17 family cytokines mediated signaling in the pathogenesis of inflammatory diseases［J］.Cellular signalling，2013，25（12）：2335-2347.

［22］Bechara R，McGeachy M J，Gaffen S L.The Metabolism-modulating activity of IL-17 signaling in health and Disease［J］.Journal of Experimental Medicine，2021，218（5）.

［23］Asukai K，Kawamoto K，Eguchi H，et al.Prognostic Impact of Peritumoral IL-17-Positive Cells and IL-17 Axis in Patients with Intrahepatic Cholangiocarcinoma［J］.Annals of Surgical Oncology，2015，22（S3）：1524-1531.

［24］Wu G S.The functional Interactions Between the MAPK and p53 Signaling Pathways［J］.Cancer Biology & Therapy，2004，3（2）：156-161.

［25］Huang J.Current developments of targeting the p53 signaling pathway for cancer Treatment［J］.Pharmacology & Therapeutics，2020：107720.

（收稿日期：2023-07-10）