溶瘤病毒聯(lián)合離子液體對腫瘤的殺傷治療研究

［摘 要］ 單純皰疹病毒2型作為溶瘤病毒的一種，能在體外對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷效果，在體內(nèi)對腫瘤組織起到抑制生長效果。香葉酸和膽堿碳酸氫鹽離子液體具有促進(jìn)藥物吸收、在組織中滯留藥物的效果。合成香葉酸-膽堿碳酸氫鹽離子液體，采用鹽復(fù)分解法制得，進(jìn)行蒸餾、重結(jié)晶法進(jìn)行提純，與一定比例PBS溶液混合，置換單純皰疹病毒2型原有的溶劑，通過對腫瘤組織細(xì)胞進(jìn)行體外殺傷、體內(nèi)治療等實(shí)驗(yàn)，證明離子液體可以使溶瘤病毒更好地滲透進(jìn)入腫瘤組織中，使溶瘤病毒長期存在腫瘤組織內(nèi)，從而加強(qiáng)溶瘤病毒對腫瘤的抑制、殺傷效果。

［關(guān)鍵詞］ 溶瘤病毒； 離子液體； 腫瘤殺傷； 腫瘤治療

［中圖分類號(hào)］ R153 ［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］ A

腫瘤和癌癥種類繁多，內(nèi)在環(huán)境復(fù)雜性，所以難以得到很好的治療[1]。對于腫瘤治療的方法有物理形式的質(zhì)子療法，和紫杉醇、順鉑類的化學(xué)療法，以及PD-1抗體藥的生物療法等。生物療法往往可以和化學(xué)療法相結(jié)合，從而獲得更好的治療效果。溶瘤病毒是一種于體內(nèi)、體外在腫瘤中進(jìn)行復(fù)制殺傷的病毒。溶瘤病毒發(fā)展至今，已有新城疫病毒、呼腸孤科病毒、單純皰疹病毒等多個(gè)不同的病毒被開發(fā)出來。其中，單純皰疹病毒又分為Ⅰ型和Ⅱ型。單純皰疹病毒Ⅱ型（oHSV-2）作為抗腫瘤藥物，剔除了ICP34.5，ICP47基因等致病基因，插入了hGM-CSF序列以募集體內(nèi)的細(xì)胞因子，對多種人源和鼠源腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的殺傷作用[2]。相比于傳統(tǒng)的I型單純皰疹病毒，Ⅱ型單純皰疹病毒可以激活RAS/MEK/MAPK通路，具有更強(qiáng)的瘤內(nèi)復(fù)制能力，可引起更強(qiáng)烈的腫瘤免疫反應(yīng)[2-3]。

離子液體是一類由只有離子組成且熔點(diǎn)低于100℃的液體電解質(zhì)。離子液體這類物質(zhì)大多是由一個(gè)或是多個(gè)有機(jī)陽離子成分與無機(jī)陰離子組成，在正常環(huán)境下較為穩(wěn)定。離子液體具有一些特殊的性質(zhì)，比如極好的有機(jī)相溶性、很好的離子電導(dǎo)率、較高的粘度比等。通過改變組分中的陽離子成分和陰離子成分的組成以及配比，離子液體可以改善目標(biāo)物質(zhì)的基本性能，使之可以用于電化學(xué)、生物傳感器、生物材料等[4]。離子液體內(nèi)存在著大量的離子電荷，電荷的排布變化極易受外界環(huán)境的影響而產(chǎn)生變化。在生物學(xué)中，尤其是對細(xì)胞組織，離子電荷的存在可以增強(qiáng)其他物質(zhì)對細(xì)胞的粘附[5-6]。香葉酸是一種植物提取物，具有芳香氣味，目前主要用于日化產(chǎn)品中，可以改善產(chǎn)品的流體性能，起到一定的抗菌抗氧化作用。膽堿碳酸氫鹽作為膽堿類物質(zhì)的一種，有調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇的代謝、傳達(dá)神經(jīng)信息、調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡等的功能。香葉酸和膽堿碳酸氫鹽是對人體較為安全無害的物質(zhì)。由兩者制成的離子液體（Latte），已經(jīng)被證實(shí)有一定的抗菌能力，對腫瘤細(xì)胞有著一定的抑制作用。不僅如此，Latte可以作為溶劑或是輔料，與藥物混合，可以使藥物由皮膚組織快速滲透進(jìn)入體內(nèi)組織，同時(shí)讓藥物在人體病灶組織中獲得更長的保留時(shí)間。這種制劑對正常細(xì)胞組織幾乎沒有損害，有著良好的生物兼容性[7-8]。

由于溶瘤病毒在體內(nèi)沒有靶向病灶的能力，原位注射是溶瘤病毒制劑最常用的一種注射方法，但這導(dǎo)致了溶瘤病毒在腫瘤組織中難以均勻地滲透擴(kuò)散，并且無法在腫瘤組織中長期存在，從而實(shí)現(xiàn)長期的抗腫瘤效果。本文研究團(tuán)隊(duì)合成了一種由香葉酸和膽堿碳酸氫鹽組成的離子液體，與Ⅱ型單純皰疹病毒共同混合成為制劑，評估了該制劑對溶瘤病毒性質(zhì)的影響，和對溶瘤病毒在腫瘤中的滲透、保留效果，以及對腫瘤組織的殺傷、抑制效果。

1 材料與方法

1.1 香葉酸膽堿碳酸氫鹽離子液體的制備

使用鹽復(fù)分解制備純膽堿和香葉酸離子液體[9]。使用電子天平準(zhǔn)確稱取一當(dāng)量純香葉酸（20 g，0.119 mol），加入至含有500 mL丙酮溶液的500 mL圓底燒瓶中，放于-70℃冰箱中進(jìn)行重結(jié)晶，重復(fù)5次。

重結(jié)晶完成后，將燒瓶取出，靜置至室溫。在燒瓶中加入一當(dāng)量體積的膽堿碳酸氫鹽（12.274 g，0.059 mol），在室溫下使用磁力攪拌器攪拌混合物直到CO2放出停止。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將燒瓶在60℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)2 h，然后在真空烘箱中在60℃下干燥96 h以去除殘留的水分，得到純凈的Latte。通過將純凈的Latte與1×PBS以體積比12.5∶87.5制得含量為12.5%的Latte溶液。

將oHSV2溶液使用真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥，然后加入Latte溶液，得到以Latte溶液為溶劑的oHSV2溶液。

1.2 香葉酸膽堿碳酸氫鹽離子液體的鑒定

香葉酸膽堿碳酸氫鹽離子液體的表征通過NMR進(jìn)行。對樣品分別進(jìn)行H1和C13鑒定。將Latte加入至DMSO-D6溶液中，以四甲基硅烷為內(nèi)參比，進(jìn)行核磁實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮罐中快速取出細(xì)胞，放入恒溫水浴鍋中快速搖晃至細(xì)胞凍存管內(nèi)固體完全融化。使用移液槍將細(xì)胞吸出，加入一個(gè)干凈的50 mL離心管中，加入5 mL完全培養(yǎng)基，使用移液槍混勻。將離心管放入醫(yī)用離心機(jī)中，設(shè)置1000 r/min 5 min。離心完成后，棄上清，加入5 mL完全培養(yǎng)基使細(xì)胞沉淀重懸混勻。

將離心管中細(xì)胞液使用移液管全部吸出至T25培養(yǎng)瓶中，放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中24 h。24 h后，從培養(yǎng)箱中取出T25培養(yǎng)瓶，棄上清，加入5 mL新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后，從培養(yǎng)箱中取出T25培養(yǎng)瓶，棄上清，重新加入1 mL無血清培養(yǎng)基輕輕清洗細(xì)胞表面，棄上清。加入1 mL胰酶消化細(xì)胞。使用顯微鏡觀察細(xì)胞至圓球狀，加入1 mL完全培養(yǎng)基中和胰酶，使用移液槍將依附在瓶底的細(xì)胞吹下來。取一個(gè)新的T75培養(yǎng)瓶。將T25瓶中的細(xì)胞液使用移液槍全部吸入T75中，繼續(xù)加入12 mL完全培養(yǎng)基，使用移液槍吹勻細(xì)胞，放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

采用LDH釋放法檢測制劑對細(xì)胞的殺傷毒性。在T75瓶中消化細(xì)胞，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用完全培養(yǎng)基稀釋約105個(gè)/ mL，96孔板單孔中加入100 μL，培養(yǎng)24 h。24 h后，使用顯微鏡觀察細(xì)胞密度達(dá)到90%。吸去96孔板中的培養(yǎng)液，使用無血清培養(yǎng)基清洗一次。每個(gè)孔板中加入100 μL含1%血清的低血清培養(yǎng)液，將各培養(yǎng)孔分成無細(xì)胞的背景空白對照孔、未經(jīng)藥物處理的樣品對照孔、未經(jīng)藥物處理的用于后續(xù)裂解的樣品最大酶活性對照孔，以及藥物處理的樣品孔。每組6個(gè)孔。在樣品處理孔中分別加入10 μL制劑。

將96孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h。到23 h時(shí)，從細(xì)胞培養(yǎng)箱里取出96孔板，在樣品最大酶活性對照孔中加入10 μL LDH釋放試劑。加入LDH釋放試劑后，反復(fù)吹打數(shù)次混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。到達(dá)24 h后，從細(xì)胞培養(yǎng)箱中將96培養(yǎng)板取出，取上清，使用離心機(jī)400 g離心5 min。分別取各孔的上清液100 μL，加入到一個(gè)新的96孔板相應(yīng)孔中。在包含上清的96孔板各孔中分別加入60 μL LDH檢測工作液，混勻，使用鋁箔包裹孔板后恒溫震蕩，緩慢搖動(dòng)，避光孵育30 min。避光孵育結(jié)束后，取出96孔板，使用酶標(biāo)儀在490 nm處測定吸光度。

1.5 病毒體外復(fù)制實(shí)驗(yàn)

為了測試病毒在不同細(xì)胞的滴度，將B16R，CT26，和A375細(xì)胞如1.4中對細(xì)胞進(jìn)行鋪板。第二天每孔加入無血清稀釋后的病毒10 μL（106個(gè)/ mL），以MOI=0.1感染oHSV2溶液和oHSV2+Latte溶液，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h 后補(bǔ)加100 μL完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。等到培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行收獲和滴度測定。使用顯微鏡觀察96孔中細(xì)胞病變孔數(shù)，進(jìn)行滴度計(jì)算。

1.6 腫瘤模型的建立

使用B16R細(xì)胞對6～7周齡的雌性C57小鼠右側(cè)皮下進(jìn)行植瘤，構(gòu)建小鼠荷瘤模型。當(dāng)腫瘤的平均體積達(dá)到 65 mm3時(shí)，分別對小鼠注射PBS，oHSV2，Latte，oHSV2+Latte，每次注射100 μL。記錄腫瘤的體積，當(dāng)腫瘤的體積到達(dá) 1500 mm3或者腫瘤的長徑到達(dá)2 cm時(shí)安樂處死小鼠。腫瘤的雙徑使用電子游標(biāo)卡尺獲得。

如1.3消化得到B16R細(xì)胞，使用離心機(jī)設(shè)置800 g，離心5 min。使用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為107/ mL。將小鼠右側(cè)腹部剃毛，使用胰島素注射器吸取100 μL腫瘤細(xì)胞懸液，對小鼠進(jìn)行皮下注射。

植瘤5 d后每天觀察植瘤部位腫瘤大小。腫瘤平均體積到達(dá)65 mm3后，開始第1次給藥治療，3 d后進(jìn)行第2次給藥，再過3 d后進(jìn)行第3次給藥。每3 d記錄一次腫瘤體積大小。

1.7 病理學(xué)切片及免疫組化實(shí)驗(yàn)

在第21天時(shí)，每組取一只老鼠，脫脊椎處死。使用手術(shù)剪剪開小鼠側(cè)腹部取出腫瘤組織，使用4%多聚甲醛溶液固定24 h。將組織從固定液取出，在通風(fēng)櫥內(nèi)用手術(shù)剪將組織去毛修整，放入脫水盒中，使用脫水機(jī)以梯度濃度的乙醇溶液進(jìn)行脫水。

將浸好蠟的組織于包埋機(jī)內(nèi)進(jìn)行包埋。先將融化的蠟放入包埋框，待蠟?zāi)讨皩⒔M織從脫水盒內(nèi)取出，放入包埋框中，于-20℃冰箱中進(jìn)行冷卻。蠟?zāi)毯髮⑾瀴K從包埋框中取出。

將冷卻的蠟塊置于石蠟切片機(jī)切片。切片漂浮于40℃溫水上，使組織展平，使用載玻片將組織撈起，于60℃烘箱內(nèi)烤片。

將切片放入蘇木素染液染5 min，使用注射水洗滌，分化液分化，注射水洗滌，返藍(lán)液返藍(lán)，進(jìn)行注射水沖洗。將切片依次使用85%、95%的乙醇溶液脫水5 min，然后放入伊紅染液中染色5 min。

將切片依次放入無水乙醇、二甲苯中脫水，使用中性樹膠封片。

在含有組織的載玻片加入100 μL破膜工作液，室溫孵育20 min，使用PBS洗3次，每次5 min。在組織中滴加3% BSA溶液，均勻分散至組織上，室溫封閉30 min。

將載玻片輕微甩動(dòng)以除去封閉液，在細(xì)胞孔板里滴加含有一抗（Anti-HSV2抗體）的PBS溶液，放于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。

細(xì)胞孔板置于脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。輕輕甩干后，在組織中滴加辣根過氧化物標(biāo)記的二抗（兔抗羊IgG Hamp;L），室溫孵育50 min。

細(xì)胞孔板置于PBS中，在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。輕輕甩干后，在組織中滴DAB顯色液，使用顯微鏡觀察組織顯色情況，使用注射水沖洗切片終止顯色。

在載玻片上滴加蘇木素復(fù)染組織3 min左右，注射水洗，滴加蘇木素分化液分化5 s，注射水洗，滴加蘇木素返藍(lán)液返藍(lán)，注射水洗。向細(xì)胞孔板依次加入梯度濃度的無水乙醇進(jìn)行脫水，使用吹風(fēng)機(jī)吹干載玻片，將有組織的一面朝下用中性樹膠封固在載玻片上。使用顯微鏡觀察，并進(jìn)行記錄拍片。使用ImageJ進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 香葉酸膽堿碳酸氫鹽離子液體的鑒定

通過Albadawi H等人的方法合成香葉酸膽堿碳酸氫鹽離子液體[9]。通過核磁共振的方法得到了與之前報(bào)道一致的H1和C13核磁共振圖[10]（圖1）。樣品在進(jìn)行旋蒸、烘干后，得到的離子液體較為純凈，無CO2、H2O殘留。

2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

抗腫瘤藥物的一個(gè)明顯特點(diǎn)就是對腫瘤細(xì)胞存在殺傷效果[11]。對于不同的腫瘤細(xì)胞，單種腫瘤藥物有著不同的殺傷效果，難以實(shí)現(xiàn)廣譜的抗腫瘤效果。本實(shí)驗(yàn)通過LDH釋放法檢測了oHSV2、Latte的腫瘤殺傷效果。實(shí)驗(yàn)所使用的溶瘤病毒來自武漢濱會(huì)生物公司研發(fā)的oHSV2，具有良好的生物活性[12]。采用LDH釋放法檢測實(shí)驗(yàn)對象對多種腫瘤細(xì)胞的毒性。如圖2所示，對于不同腫瘤細(xì)胞，單獨(dú)使用Latte溶液有著不同的殺傷效果，主要區(qū)別在于針對的是人腫瘤細(xì)胞A375或鼠腫瘤細(xì)胞B16R、CT26。離子液體Latte對人源腫瘤細(xì)胞的殺傷效果明顯強(qiáng)于鼠源細(xì)胞，這可能是由于不同物種之間細(xì)胞的組成所導(dǎo)致的。oHSV2對B16R、CT26和A375腫瘤細(xì)胞均有較好的殺傷效果，在不同細(xì)胞之間幾乎無差別。oHSV2+Latte兩者進(jìn)行聯(lián)用，加強(qiáng)了對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。

2.3 病毒滴度實(shí)驗(yàn)

溶瘤病毒會(huì)對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行侵染、復(fù)制，這是溶瘤病毒的一個(gè)顯著特點(diǎn)。溶瘤病毒在腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制能力體現(xiàn)在其滴度水平[13]。溶瘤病毒在治療腫瘤時(shí)的效果主要是由其自身的滴度和外界腫瘤環(huán)境決定的，與細(xì)胞和腫瘤的周期無關(guān)[14]。若是溶瘤病毒受到外界的刺激而進(jìn)行不受控制的病毒復(fù)制，那么可能會(huì)引起機(jī)體的免疫原性[15]。相反的，若是離子液體抑制病毒復(fù)制，由于溶瘤病毒是依靠劫持腫瘤細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成從而破壞腫瘤細(xì)胞的，這會(huì)導(dǎo)致藥物起不到預(yù)期的治療效果[16]。本實(shí)驗(yàn)中，采用CCID50的方法來檢測離子液體對溶瘤病毒在不同細(xì)胞中的滴度差異[17]。如圖3所示，在多種細(xì)胞系中，Latte對oHSV2在不同細(xì)胞中的滴度并不會(huì)產(chǎn)生影響，oHSV2保持了一個(gè)較好的滴度水平。

2.4 腫瘤生長抑制實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證Latte和oHSV2的抗腫瘤活性，通過建立A375小鼠腫瘤模型，在腫瘤體積達(dá)到65 mm3時(shí)進(jìn)行注射治療。許多抗腫瘤藥物在對小鼠腫瘤模型無法得到有效的效果，不僅僅是因?yàn)槟[瘤微環(huán)境的問題[18]，亦有部分是因?yàn)樗幬飳τ谀[瘤的特異性不同[19]。如圖4、圖5所示，相比于空白對照組，Latte和oHSV2均可以抑制腫瘤的生長，兩者聯(lián)用可以起到更好的抑制效果。相比于Latte或oHSV2單獨(dú)使用，Latte+oHSV2聯(lián)用不僅可以更有效地抑制腫瘤在小鼠體內(nèi)的生長，同時(shí)延長了小鼠的生存周期。

2.5 病理學(xué)切片及免疫組化實(shí)驗(yàn)

體內(nèi)的腫瘤組織中有著密集的血管，很多抗腫瘤藥物在沒有被吸收的情況下就被代謝排除，導(dǎo)致治療效果很差[20-21]。離子液體Latte由于其特殊的性質(zhì)，在藥物和細(xì)胞組織之間形成不同的滲透壓，可以使藥物更快滲透進(jìn)入腫瘤組織。Latte的性質(zhì)比較穩(wěn)定，在體內(nèi)的半衰期時(shí)間較長。由于腫瘤中細(xì)小的血管無法快速清除具有一定粘度的離子液體，通過瘤內(nèi)注射的方式會(huì)使得藥物長時(shí)間存在腫瘤組織中。如圖6所示，通過HE染色組織切片可以看出，相比于對照組，Latte組的腫瘤組織存在著細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，細(xì)胞的活力明顯不如其他各組，說明組織產(chǎn)生了一定的病變；oHSV2組腫瘤組織中的細(xì)胞存在著被侵染的現(xiàn)象，細(xì)胞之間形成了合胞體；Latte+oHSV2組同時(shí)存在著上述兩種情況。通過免疫染色可以發(fā)現(xiàn)。在注射了不同的oHSV2制劑多天以后，小鼠腫瘤內(nèi)仍然存在著部分oHSV2，Latte的存在使得更多的oHSV2保留了下來。

3 結(jié)論

溶瘤病毒作為生物免疫療法的一類代表性藥物，可以有效促進(jìn)體內(nèi)的IFN-γ、PD-L1水平上調(diào)[22]。本研究成功合成了香葉酸膽堿碳酸氫鹽離子液體，并將離子液體與Ⅱ型單純皰疹病毒混合得到了Latte+oHSV2混合制劑。該制劑對不同的腫瘤細(xì)胞有不同的殺傷效果，不影響溶瘤病毒在體外的病毒復(fù)制過程。對于治療體內(nèi)實(shí)體瘤，該制劑能有效延長小鼠的生存周期，在較長時(shí)間范圍內(nèi)抑制腫瘤的生長，對腫瘤組織有一定的殺傷效果。離子液體的存在可以使溶瘤病毒快速、均勻地在腫瘤組織中擴(kuò)散、滲透，使得溶瘤病毒可以長期在腫瘤組織中存在。

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A Study of Tumour Killing Therapy with Oncolytic VirusCombined with Ionic Liquid

GU Ziyang，CUI Yanfang，LIU Binlei

（School of Biological Engineering and Food Science，Hubei Univ. of Tech.，Wuhan 430068，China）

Abstract： Herpes simplex virus type 2， a type of oncolytic virus， has a killing effect on tumour cells in vitro and a growth inhibiting effect on tumour tissue in vivo. Geranylic acid and choline bicarbonate ionic liquids have the effect of promoting drug absorption and retaining the drug in the tissues. In this paper， we synthesized geranylic acid choline bicarbonate ionic liquid， made by salt complex decomposition， distilled and purified by recrystallisation， and replaced the original solvent of herpes simplex virus type 2 by mixing with a certain proportion of PBS solution. The tumour killing effect of oncolytic virus is enhanced by the long-term presence of oncolytic virus in the tumour tissue.

Keywords： oncolytic virus; ionic liquids; tumour killing; oncology treatment

［責(zé)任編校： 張 眾］

［收稿日期］ 2022-03-12

［第一作者］ 顧子揚(yáng)（1997-）， 男，" 江蘇無錫人，湖北工業(yè)大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)樯镏扑帯?/p>