HPV16E6-295T/G和E6-350T/G變異位點影響IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1和IRF9蛋白質表達的研究

李楊楊 辛慧珍 郭柄軒 王慧娟 宋樹言 李洪濤 李冬妹 潘澤民

摘要：目的 探討HPV16 （Human Papillomavirus Type 16）E6-295T/G和E6-350T/G變異位點對IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1和IRF9蛋白質表達的影響。方法 在宮頸癌細胞C33A（HPV陰性）中分別轉染真核表達載體295G/350G-GV230、295T/350G-GV230和295T/350T-GV230作為實驗組，以NC-GV230作為對照組。通過免疫組織化學法、Western blot方法檢測HPV16 E6 295T/G、350T/G不同變異位點對IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1和IRF9蛋白質表達的影響。通過IBM SPSS Statistics 26軟件對實驗結果進行統計學分析，P＜0.05為差異具有統計學意義，免疫組織化學法定量采用image J軟件進行陽性細胞計數。結果 Western blot結果顯示，免疫分子干擾素κ （Interferon Kappa，IFNκ）的表達，HPV16 E6-295G/350G變異組較HPV16 E6-295T/350T原型組和HPV16 E6-295T/350G組降低（P<0.01，P<0.05）。HPV16 E6-295G/350G變異組的免疫分子主要組織相容性復合體I類 （Major Histocompatibility Complex Class I，MHC-I）的表達顯著低于 HPV16 E6-295T/350T原型組和HPV16 E6-295T/350G組（P<0.05）。HPV16 E6-295G/350G變異組的信號轉導子和轉錄激活子1 （Signal Transducer and Activator of Transcription 1，STAT1）表達顯著低于 HPV16 E6-295T/350T原型組和 HPV16 E6-295T/350G組（P<0.05，P<0.01）。變異組HPV16 E6-295G/350G與 HPV16 E6-295T/350T原型組和HPV16 E6-295T/350G變異組相比，干擾素調節因子9 （Interferon Regulatory Factor 9，IRF9）表達顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結論 HPV16病毒E6蛋白質可以降低IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1和IRF9的蛋白質表達水平，E6基因T295G/T350G變異降低這些分子的表達作用最強。

關鍵詞：宮頸癌；HPV16；E6基因；基因變異；蛋白質表達

中圖分類號：中圖分類號R737.33文獻標志碼：A文獻標識碼

Study on the influence of HPV16 E6-295T/G and E6-350T/G variation

sites on the protein expression of IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1 and IRF9

LI? Yangyang 1，XIN? Huizhen2，GUO Bingxuan1，WANG Huijuan1，SONG Shuyan1，

LI Hongtao3，LI Dongmei1，PAN Zemin1*

（1 Department of Biochemistry and Molecular Biology，School of Medicine/Key Laboratory of Xinjiang Endemic and

Ethnic Diseases，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832002，China;

2 Department of Biology， School of Basic Medicine，

Xinjiang Medical University， Urumqi， Xinjiang 830017， China;

3 Department of Anatomy and Histology and Embryology，

School of Medicine，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832002，China）

Abstract：? Objective To explore the effect of variation sites E6-295T/G and E6-350T/G on the protein expression of? IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1 and IRF9. Methods Cervical cancer cells C33A were transfected with eukaryotic expression vectors 295G/350G-GV230， 295T/350G-GV230， 295T/350T-GV230 as the experimental group and NC-GV230 as the control group. Immunohistochemistry and Western blot methods were used to detect the effects of HPV16 E6 295T/G and 350T/G variation sites on IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1 and IRF9. IBM SPSS Statistics 26 software was used for statistical analysis of the experimental results. P<0.05 was considered statistically significant. Immunohistochemical method was used to quantitatively count positive cells by image J software. Results The results of Western blot showed that the expression of IFNκ was decreased in the HPV16 E6-295G/350G variant group compared with the HPV16 E6-295T/350T prototype group and HPV16 E6-295T/350G （P<0.05， P<0.01）. The expression of MHC-I in the HPV16 E6-295G/350G variants was significantly lower than that of HPV16 E6-295T/350T prototype group and HPV16 E6-295T/350G （P<0.05）. The expression of STAT1 was significantly lower in HPV16 E6-295G/350G variant group than in HPV16 E6-295T/350T prototype group and HPV16 E6-295T/350G （P<0.01， P<0.05）. IRF9 in HPV16 E6-295G/350G was significantly decreased than that of HPV16 E6-295T/350T prototype group and HPV16 E6-295T/350G （P<0.05，P<0.01）. Conclusion HPV16 E6 protein can reduce the expression of IFNκ， MHC-Ⅰ， STAT1 and IRF9， and E6 gene 295G/350G variation has the strongest effect on reducing the expression of these molecules.

Key words： cervical cancer;HPV16;E6 gene;gene variation;protein expression

宮頸癌是危害女性健康的主要惡性腫瘤之一［1］，感染高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）是造成宮頸癌發生的主要原因［2］。

迄今為止，人類已經發現了200多種HPV類型［3］ ，其中主要分為高危（HR）和低危（LR）2種類型，其中HPV16型是最常見的HR型［4］。HPV主要編碼8個開放閱讀框（ORF），該病毒表達“早期”E1、E2、E4、E5、E6和E7蛋白質，以及“晚期”衣殼蛋白質L1和L2［5］。除了宮頸癌，相當大比例的外陰、陰道、陰莖、肛門和口咽癌都是由HPV引起的［6］，HPV陽性癌細胞的生長取決于病毒E6和E7 癌基因的持續表達［7］ 。E6和E7的靶標分別是p53腫瘤抑制蛋白質和視網膜母細胞瘤腫瘤抑制蛋白質pRB［8］ ，HPV癌蛋白質能夠通過促進增殖，抑制細胞凋亡以及阻止上皮細胞分化，從而驅使感染的細胞向腫瘤發展［9］ ，全球HPV相關癌癥的發病率仍然很高，特別是在亞洲和撒哈拉以南非洲，盡管有預防感染的疫苗可用，但是疫苗并不能治愈既定的感染或疾病［4］。

據相關報道宮頸癌在新疆高發［10］。有研究表明，E6和E7基因的多重變異能夠致使HPV16病毒抗原性、免疫原性以及易感性產生變化［11］。新的證據表明，抑制E6和E7可以重新激活宿主的先天免疫反應，逆轉適合病毒持續感染和腫瘤發生的細胞狀態［12］。破壞不同的免疫逃避機制是宮頸癌治療的一個重要方向，為了深入探究E6和E7誘導的免疫逃避和宮頸癌進展之間的關系。前期研究新發現了宮頸癌中HPV16病毒E6基因295T/G、350T/G變異位點。

本研究旨在通過真核轉染實驗，研究HPV16 E6-295T/G和E6-350T/G變異位點對IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1和IRF9蛋白質表達的影響，為預防和治療宮頸癌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞來源

宮頸癌C33A細胞（HPV陰性）株由本實驗室保存提供。

1.2 質粒的構建

HPV16 E6原型和變異型真核表達載體均由上海吉凱基因公司進行設計構建，分別構建HPV16 E6 原型 295T/350T-GV230、HPV16 E6 變異型 295G/350G-GV230 和 295T/350G-GV230 表達載體，其中以NC-GV230作為對照。

1.3 主要試劑

主要試劑詳見表1。

1.4 細胞培養

將宮頸癌細胞C33A培養在CO2含量為5%的37℃恒溫培養箱中，用含量為90%DMEM+10%胎牛血清+1%雙抗（青霉素+鏈霉素）的完全培養基進行培養，當細胞傳代至3代以后，等到細胞生長密度達到90%左右時用含0.25%乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化后離心。將離心后的細胞沉淀使用DMEM重懸后計數，計數結束后計算每孔接種細胞數為4×104的體積，按照計算出的體積將C33A細胞接種于六孔培養皿中置于培養箱中培養。次日至細胞生長密度達到約30%時，使用FuGENEHD轉染試劑進行轉染，將不同處理組做上標記，轉染后4～6 h換液，置于培養箱中繼續培養用以接下來的實驗。

1.5 qRT-PCR檢測HPV16 E6的表達

先用Trizol法在冰上提取各組細胞的總RNA，加入少量無酶水溶解提取的RNA，之后使用Takara的TB Green Premix Ex Ta試劑擴增內參基因GAPDH以及HPV16 E6基因。得到擴增數據，進行數據分析。將內參基因設置為基準，擴增數據通過歸一化處理之后利用2-ΔΔCT的方法進行計算，得到各組的mRNA表達數據，利用GraphPad Prism 8軟件作圖。擴增所用序列詳見表2。

1.6 Western blot實驗

在細胞轉染48h之后使用RIPA裂解液提取細胞的總蛋白質 ，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離提取好的細胞總蛋白質樣品，提前配置好聚丙烯酰胺凝膠，按照順序在膠孔中加入適量提取的細胞總蛋白質，將穩壓儀的電壓先調至80V電泳30 min，蛋白質電泳出濃縮膠后，電壓調大到110V繼續電泳1 h左右；蛋白質轉膜條件為110V半干轉1 h（轉膜全程冰浴防止電轉過程中過熱）。轉膜結束后使用1×TBST配置含5%脫脂奶粉的封閉液，將電轉好的膜置于封閉液中常溫封閉2h。提前稀釋好一抗（IFNκ1∶500，MHC-I 1∶1 000，STAT1 1∶1 000，IFR9 1∶1 000）后裁好條帶，一抗覆蓋至相應泳道位置后，置于冰箱中4℃孵育過夜12～16h（以GAPDH作為內參）。次日，按類別回收一抗，條帶使用1×TBST 洗滌3次，提前稀釋好二抗（山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG均按照1∶5 000稀釋）常溫下孵育相應的二抗2 h，結束以后用1×TBST洗滌帶3次后利用化學成像發光系統對目的分子的條帶進行曝光檢測其蛋白質表達，保存好數據，用于后續處理。

1.7 免疫組織化學法檢測細胞內IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1和IRF9的表達

制作細胞滴片步驟是：洗掉培養基，使用胰酶消化細胞，收集好細胞，使用PBS重懸細胞，3 000 r·min-1離心后棄上清。向細胞沉淀加入500 μL的4%多聚甲醛后靜置20min。離心3 000 r·min-1時間5min，加入PBS重懸。棄上清后離心3 000 r·min-1時間5min，加入500 μL的0.1%TritonX-100后靜置15min。離心3 000 r·min-1時間5min，加入PBS重懸。棄上清后離心3 000 r·min-1時間5min，加入適量PBS重懸，取適量懸液滴至載玻片，于顯微鏡下觀察細胞密度，以細胞單層且密度60%～80%為宜，靜置數分鐘后放入通風櫥干燥后冷凍。

次日將準備好的凍細胞滴片取出靜置，平衡至室溫使之融化，使用1×PBS洗滌細胞滴片3次，每次 5 min。

提前稀釋好一抗（IFNκ1∶100，MHC-I 1∶800，），將洗滌后的滴片置于濕盒內使用免疫組織化學法專用油性筆將每個細胞范圍圈住防止液體流出，每孔滴加適量一抗，蓋嚴濕盒，放在冰箱中4℃孵育過夜12～16 h（濕盒內加水要防止干燥）。第二天早上復溫，將濕盒輕緩取出并置于37℃烘箱中30 min。用1×PBS緩沖液充分洗滌細胞滴片3次，每次5 min，擦拭凈滴片上多余的1×PBS，滴加適量的對應的二抗，在37℃烘箱中反應30 min。1×PBS洗滌細胞滴片上多余的二抗3次，每次5 min，擦拭凈滴片上多余的1×PBS，滴加DAB液進行顯色反應。顯色合適后用水沖掉DAB顯色液從而終止顯色反應。將顯完色的滴片浸入蘇木素染液中進行3 min的復染操作，用自來水沖洗，酸化置于鹽酸酒精中4～6s立即取出，再用自來水沖洗幾次，而后置于自來水中5 min。將處理好的細胞滴片順次放于70%、85%、90%和無水乙醇，分別脫水5 min，再將滴片順次放入二甲苯I，II中各5 min，后室溫或者65℃烘箱中靜置待干，最后在滴片上滴加適量中性樹膠，蓋上蓋玻片封好滴片。在顯微鏡下觀察染色結果，采圖做好記錄。

1.8 統計學分析

數據處理均使用IBM SPSS Statistics 26軟件進行統計學分析。計量資料用均數±標準差表示，對服從正態分布且方差齊的多組比較采用方差分析，運用t檢驗進行組間比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 過表達質粒變異位點的檢測

構建295G/350G、295T/350G、295T/350T過表達質粒并對其中突變位點進行檢測得到295G/350G、295T/350G、295T/350T位點的測序峰圖（圖1）。

2.2 qRT-PCR檢測轉染過表達質粒后HPV16 E6基因的mRNA表達

在宮頸癌細胞C33A中轉染295G/350G、295T/350G、295T/350T表達質粒作為實驗組，以NC-GV230作為對照組。選擇從mRNA水平上采用qRT-PCR來檢測HPV16 E6基因的mRNA表達，結果顯示與對照組相比各實驗組的HPV16 E6基因的mRNA表達水平明顯增高，證明在轉染過表達真核載體后，HPV16 E6基因成功表達（圖2）。

2.3 不同HPV16 E6基因變異型對免疫相關分子IFNκ表達影響

在宮頸癌細胞C33A中轉染HPV16 295G/350G、295T/350G、295T/350T表達質粒作為實驗組，以NC-GV230作為對照組。利用免疫組織化學方法和 Western blot實驗檢測各組細胞內免疫分子IFNκ的表達水平，免疫組織化學結果顯示HPV16 E6-295G/350G（圖3C）和 HPV16 E6-295T/350G（圖3D）變異組與 NC 組（圖3A）比較顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05，P<0.001）（圖3E），Western blot 檢測細胞內的IFNκ結果顯示三個實驗組與 NC 比較表達均顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05，P<0.01，P<0.001）（圖4），HPV16 E6-295G/350G 變異組與HPV16 E6 295T/350T 原型組比較顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01），變異組HPV16 E6-295G/350G與HPV16 E6-295T/350G 相比，免疫分子IFNκ的表達顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05）（圖4）。

2.4 不同HPV16 E6基因變異型對免疫相關分子MHC-I表達影響

在宮頸癌細胞C33A中轉染HPV16 295G/350G、295T/350G、295T/350T表達質粒作為實驗組，以NC-GV230作為對照組。利用免疫組織化學方法和 Western blot 實驗檢測各組細胞內免疫分子MHC-I的表達水平，免疫組織化學結果顯示HPV16 E6-295G/350G（圖5C）和 HPV16 E6-295T/350G（圖5D）變異組與NC組（圖5A）比較表達水平顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.01）（圖5E）；Western blot 檢測細胞內的MHC-I表達水平，結果顯示3個實驗組與NC組比較均顯著降低，差異具有統計學意義，HPV16 E6-295G/350G變異組與HPV16 E6 295T/350T原型組比較MHC-I表達顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05），變異組HPV16 E6-295G/350G與HPV16 E6-295T/350G相比，MHC-I表達顯著降低（P<0.05）（圖6）。

2.5 不同HPV16 E6 基因變異型對STAT1表達的影響

在宮頸癌細胞C33A中轉染HPV16 295G/350G、295T/350G、295T/350T表達質粒作為實驗組，以NC-GV230作為對照組。

Western blot 檢測細胞內的STAT1的表達結果顯示HPV16 E6-295G/350G變異組、HPV16 E6-295T/350G變異組和HPV16 E6 295T/350T原型組與對照組之間相比較均顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.001，P<0.05，P<0.01），變異組HPV16 E6-295G/350G與HPV16 E6-295T/350T和HPV16 E6-295T/350G相比STAT1表達顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01） （圖7）。

2.6 不同HPV16 E6基因變異型對IRF9表達的影響

在宮頸癌細胞C33A中轉染HPV16 295G/350G、295T/350G、295T/350T表達質粒作為實驗組，以NC-GV230作為對照組。

Western blot檢測細胞內的IRF9的表達結果顯示：HPV16 E6-295G/350G變異組、HPV16 E6-295T/350G變異組和HPV16 E6 295T/350T原型組與對照組之間比較均有明顯降低，差異具有統計學意義（P<0.001，P<0.05，P<0.001），且變異組HPV16 E6-295G/350G與HPV16 E6-295T/350G和HPV16 E6-295T/350T相比IRF9表達顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.01，P<0.05）（圖8）。

3 討論

HPV相關基因變異以及特定類型HPV感染易感性同宮頸病變進展之間的關系尚不清楚［13］。有相關研究報道，在HPV感染的早期階段，HPV16病毒的E6致癌蛋白質能夠抑制免疫分子基因蛋白質的表達，使病毒可以逃脫免疫的抑制作用，進而使得病毒不斷增殖，造成機體持續感染。研究發現，E6蛋白質可以破壞免疫分子的表達，影響機體細胞清除HPV的感染。HPV整合到宿主細胞基因組中會導致E6表達上調，從而導致HPV感染的細胞惡性轉化［14］。

課題組前期在新發現的HPV16病毒基因組變異位點中，發現E6基因中的295T/G和350T/G致病變異位點 。通過構建真核表達載體，選擇HPV陰性的宮頸癌C33A細胞進行轉染，在mRNA水平上通過qRT-PCR驗證HPV16病毒癌基因E6的表達，利用免疫組織化學實驗以及Western blot實驗發現，增加HPV16病毒E6基因表達，可以降低IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1和IRF9的表達，且HPV16病毒E6-295G/350G位點的變異對這些基因蛋白質表達抑制作用最強。病毒與免疫系統的斗爭一直在進行中，為了能夠成功感染宿主，病毒進化出了能夠對宿主進行免疫逃逸并持續感染的策略，一旦逃脫了免疫分子的抑制作用，病毒便可不斷增殖。因此，通過探究HPV16的致病變異位點對免疫相關分子表達的影響對宮頸癌的防治具有十分重要的意義。

相關研究表明免疫分子IFNκ在正常角質形成細胞中表達，HPV16病毒的E6和E7兩個癌蛋白質都能夠抑制IFN的表達，而E6抑制程度較大［15］。MHC- I在大多數有核細胞表面呈遞多肽，使免疫系統能夠檢測和清除感染或惡性轉化的細胞［16］。研究發現，STAT1蛋白質通過在細胞核內轉導I型、II型和III型IFN信號，在針對病毒和其他病原體的免疫反應中發揮關鍵作用。STAT1激活了數百個基因的轉錄，其中一些基因已經被很好地描述為抗病毒特性［17］。IRF9在調節I型干擾素和干擾素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISG）在相關信號通路中的表達方面發揮重要作用［18］。

研究表明當干擾素表達被抑制，IFNκ的非磷酸干擾素刺激基因因子3（unphosphorylated interferon-stimulated gene factor 3，U-ISGF3）復合物作用途徑可以影響抗病毒的免疫分子的表達［19］。據報道高危HPV病毒癌基因E6的作用途徑在角質形成細胞中靶向作用IFNκ，使得干擾素信號途徑中U-ISGF3復合物的 STAT1和IRF9基因表達水平降低，進而影響細胞抗病毒狀態［20］。在本項研究中，通過檢測IFNκ、MHC-I、STAT1和IRF9的蛋白質表達水平，可以觀察到轉染HPV16病毒不同變異位點的E6基因后，這四種蛋白質表達水平顯著降低，且其中E6-295G/350G變異組對這些基因的蛋白質表達抑制程度較大，從而影響抗病毒作用，可能導致HPV16處于持續感染狀態，最終可能導致宮頸癌的發生。

本研究發現HPV16病毒E6基因可以降低IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1和IRF9的表達，其中E6-295G/350G變異位點對免疫分子的抑制作用大于E6-295T/350G和E6-295T/350T變異位點，這為預測HPV16病毒風險和防治宮頸癌有重要的意義。對于已經感染HPV的婦女來說，倘若能夠尋找到方法抑制病毒致癌基因的表達，提高機體免疫分子的表達，能夠使機體容易清除HPV的感染，這將會為廣大女性帶來福音。對于HPV16病毒降低免疫分子的機制仍需要進一步深入的研究。

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（責任編輯：編輯唐慧）