青黛對(duì)炎癥性腸病TGF-β1/Smad 3信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)的臨床研究

胡招兵　潘華　賈志紅

【摘要】 目的：探討青黛對(duì)炎癥性腸病轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1/信號(hào)傳導(dǎo)蛋白3（TGF-β1/Smad 3）信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)的臨床效果。方法：選取2021年1月—2023年1月在景德鎮(zhèn)市第二人民醫(yī)院被確診為潰瘍性結(jié)腸炎或克羅恩病的患者共80例，根據(jù)隨機(jī)抽簽方式對(duì)其進(jìn)行分組，包括觀察組和對(duì)照組，兩組各40例，對(duì)照組采取常規(guī)治療，觀察組則在此基礎(chǔ)上采取青黛口服治療，連續(xù)治療2個(gè)月。比較兩組臨床療效、TGF-β1/Smad 3表達(dá)、免疫功能及不良反應(yīng)。結(jié)果：觀察組治療總有效率為90.00%，明顯高于對(duì)照組的60.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。治療前，兩組TGF-β1/Smad 3表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；治療后兩組TGF-β1/Smad 3 protein及mRNA表達(dá)均高于治療前，且觀察組均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。治療后，兩組CD3+、CD4+水平均高于治療前，CD8+水平均低于治療前，且觀察組CD3+、CD4+水平均高于對(duì)照組，CD8+水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。觀察組和對(duì)照組治療不良反應(yīng)總發(fā)生率分別為10.00%、20.00%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：青黛可通過修復(fù)炎癥性腸病患者TGF-β1/Smad 3信號(hào)通路，改善臨床療效，具有較高臨床價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 青黛 炎癥性腸病 TGF-β1/Smad 3信號(hào)通路

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）指的潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病集合，目前臨床對(duì)于其發(fā)生原因尚不十分明確，并且癥狀缺乏特異性[1]。當(dāng)前全球發(fā)病人數(shù)約2 800萬例，且有逐漸升高的趨勢(shì)。IBD發(fā)病率在不同地區(qū)差異顯著，但總體上與當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展水平和城市化水平呈正相關(guān)。歐洲和北美發(fā)達(dá)國(guó)家的發(fā)病率明顯高于亞洲、非洲和南美洲的發(fā)展中國(guó)家。然而近年來，潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病率和流行率在發(fā)展中國(guó)家呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且在南美和東亞地區(qū)最為明顯[2]。目前我國(guó)國(guó)內(nèi)報(bào)道以潰瘍性結(jié)腸炎為主，其發(fā)病率最高的區(qū)域?yàn)閺V東省，為3.14/10萬，其次為湖北省，為1.96/10萬[3]。另外，潰瘍性結(jié)腸炎在男女之中的發(fā)病率并無明顯差異，發(fā)病高峰年齡是20～49歲[4]；克羅恩病發(fā)病高峰年齡為18～35歲，男性略多于女性[3]。據(jù)2014年中國(guó)疾病預(yù)防控制中心數(shù)據(jù)預(yù)計(jì)到2025年，中國(guó)IBD患者將達(dá)到150萬例[5]。IBD具有復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，目前大多認(rèn)為其發(fā)病與多種因素相關(guān)，包括慢性炎癥狀態(tài)下的異常免疫反應(yīng)和以炎癥因子為主的細(xì)胞因子失衡，包括自身免疫反應(yīng)和抗炎途徑的損傷，以及腦腸軸的紊亂[6]。中醫(yī)在我國(guó)的發(fā)展有近千年的歷史，在長(zhǎng)時(shí)間對(duì)于炎癥性腸病的診治中總結(jié)出相應(yīng)的診療體系，并有利于當(dāng)前臨床對(duì)于此類疾病的治療[7]。中醫(yī)雖無炎癥性腸病這一病名，但是可根據(jù)患者病情表現(xiàn)以“腸癖”“泄瀉”“滯下”等癥對(duì)其進(jìn)行概括，主要因外感濕熱邪氣、脾氣運(yùn)化不足使得濕濁之氣阻滯下注大腸，導(dǎo)致臟腑失調(diào)，濕熱內(nèi)蘊(yùn)，久則傷腸，化以腹瀉，對(duì)其治療應(yīng)以清熱除燥除濕為主，中藥材青黛屬于一味清熱藥，可清解熱毒、涼血消斑，在以往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)其能有效改善潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道損傷，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子/信號(hào)傳導(dǎo)蛋白（TGF-β/Smad）被認(rèn)為是該藥發(fā)揮效果的重要通路[8]。本文對(duì)青黛用于IBD的治療機(jī)制及效果進(jìn)行探討，從而為其未來治療方向提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年1月—2023年1月在景德鎮(zhèn)市第二人民醫(yī)院被確診為潰瘍性結(jié)腸炎或克羅恩病的患者共80例，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）接受影像學(xué)檢查且術(shù)后經(jīng)病理診斷為炎癥性腸病，符合文獻(xiàn)[9]有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的描述；中醫(yī)辨證中主次癥均符合熱毒熾盛型的相應(yīng)表現(xiàn)。（2）30～50歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他自身免疫性疾病；（2）存在其他類型腸炎或是因明確的細(xì)菌感染所致腸道癥狀；（3）已導(dǎo)致腸穿孔等可能危及生命的并發(fā)癥；（4）身體多器官功能不能正常運(yùn)轉(zhuǎn)，或已合并癌癥，預(yù)計(jì)生存期不足1個(gè)月；（5）意識(shí)狀態(tài)異常或者明確精神病史；（6）處于特殊生理期的女性。根據(jù)隨機(jī)抽簽方式分為觀察組和對(duì)照組，兩組各40例，本次試驗(yàn)的開展是建立在景德鎮(zhèn)市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，患者和家屬均知曉本次研究，且同意參與。

1.2 方法

（1）對(duì)照組：采取炎癥性腸病基礎(chǔ)治療及干預(yù)，包括飲食控制、作息調(diào)節(jié)、血壓及體溫控制等，口服美沙拉嗪腸溶片（生產(chǎn)廠家：葵花藥業(yè)集團(tuán)佳木斯鹿靈制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H19980148，規(guī)格：0.25 g）進(jìn)行治療，1片/次，3次/d，連續(xù)服用2個(gè)月。（2）觀察組：在對(duì)照組基礎(chǔ)上加用青黛一方（方劑：青黛）顆粒口服（1.5～3 g）或灌腸（灌腸30 g），1劑/次，2次/d，連續(xù)使用2個(gè)月。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

（1）臨床療效：根據(jù)當(dāng)前有關(guān)炎癥性腸病治療評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，均通過體征、腸鏡檢查進(jìn)行判斷，患者癥狀消失，腸鏡檢查未發(fā)現(xiàn)腸黏膜異常時(shí)表示顯效；臨床癥狀較治療前改善，結(jié)腸鏡僅顯示輕微炎癥為有效；病情無變化或加重則表示無效[10]。總有效率=（顯效+有效）例數(shù)/總例數(shù)×100%。（2）TGF-β1/Smad 3表達(dá)：分別于治療前后留取患者腸鏡活檢組織，將其置于10%聚乙烯醇中，在-80 ℃的冷凍室中保存，分別采用Western blot及實(shí)時(shí)熒光定量法（RT-PCR）檢測(cè)TGF-β1、Smad 3蛋白及信使核糖核酸（mRNA），采用Western blot法時(shí)加入裂解液裂解，提取總蛋白，通過BCA法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)在進(jìn)行蛋白變性之后，用等量的蛋白上樣，再經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、轉(zhuǎn)膜，在5%脫脂奶粉在室溫封閉1 h之后，順序加入一抗、二抗，用Image J圖像分析軟件來測(cè)量其蛋白灰度值；用RT-PCR法測(cè)定在液氮中研磨的TGF-β1、Smad 3 mRNA的表達(dá)量，加入適量裂解液，在超低溫勻漿器中勻漿，在離心之后，將上清液提取出來，用RNA試劑盒來提取總RNA，用超微量分光光度計(jì)來提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后采取PCR，同時(shí)對(duì)20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行配置，并根據(jù)試劑盒說明書擴(kuò)增，以β-action為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt法，對(duì)比兩組TGF-β1/Smad 3表達(dá)情況。（3）免疫功能：于治療前后采集患者空腹靜脈血5 mL，離心后采取流式細(xì)胞儀法檢測(cè)T淋巴亞群（CD3+、CD4+、CD8+）水平。（4）對(duì)患者治療期間出現(xiàn)的不良反應(yīng)進(jìn)行觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析通過軟件SPSS 22.0來運(yùn)行，計(jì)數(shù)資料、計(jì)量資料分別以率（%）、（x±s）表示，并通過字²檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料比較

觀察組男24例，女16例，年齡30～50歲，平均（38.72±5.34）歲；潰瘍性結(jié)腸炎28例，克羅恩病12例；病程2～5年，平均（3.65±1.22）年；對(duì)照組包括男20例，女20例；年齡30～45歲，平均（38.09±4.14）歲；潰瘍性結(jié)腸炎24例，克羅恩病16例；病程2～5年，平均（3.65±1.22）年；兩組性別、年齡、病程、病變類型等基線資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 兩組臨床療效比較

觀察組治療總有效率為90.00%，明顯高于對(duì)照組的60.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字²=9.600，P=0.002），見表1。

2.3 兩組治療前后TGF-β1/Smad 3表達(dá)比較

治療前，兩組TGF-β1/Smad 3表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；治療后，兩組TGF-β1/Smad 3 protein及mRNA表達(dá)均高于治療前，且觀察組均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.4 兩組治療前后免疫功能水平比較

治療前，兩組CD3+、CD4+、CD8+比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；治療后，兩組CD3+、CD4+水平均高于治療前，CD8+水平均低于治療前，且觀察組CD3+、CD4+水平均高于對(duì)照組，CD8+水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.5 兩組治療不良反應(yīng)比較

觀察組和對(duì)照組治療不良反應(yīng)總發(fā)生率分別為10.00%、20.00%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字²=1.569，P=0.210），見表4。

3 討論

IBD雖然不是腫瘤，但屬癌前病變，不僅會(huì)出現(xiàn)終身復(fù)發(fā)趨勢(shì)，還會(huì)對(duì)患者造成永久性的身心傷害，除了需要長(zhǎng)期吃藥之外，還要承受消化道的各種不適，如便血、腹痛、腹瀉等，這對(duì)患者的工作和生活都會(huì)產(chǎn)生很大的影響。特別是由于反復(fù)的炎癥反應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致腸道的纖維化，從而引發(fā)腸腔狹窄、梗阻和癌變等嚴(yán)重的并發(fā)癥。臨床上常用的藥物有氨基水楊酸類、皮質(zhì)類固醇類和免疫抑制劑等，但只能改善癥狀，療效和預(yù)后并不理想[11]。目前已有的微生態(tài)制劑及與奧沙拉嗪聯(lián)用等手段為IBD的治療提供了新思路，但仍需要進(jìn)一步的研究。上海市名醫(yī)馬貴同教授認(rèn)為“濕熱瘀結(jié)”是IBD的核心病機(jī)，以“清熱化濕、活血止血”為治法，故而將青黛、三七等中藥制成直腸給藥制劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)青黛在其中起了重要作用[12]。

本研究結(jié)果顯示，觀察組治療總有效率為90.00%，明顯高于對(duì)照組的60.00%，提示青黛用于IBD可獲取良好的療效。青黛味道咸，性涼，歸肝肺胃經(jīng)，具有清熱、涼血、解毒的功效。現(xiàn)代醫(yī)藥的藥理學(xué)研究顯示，青黛有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)黏膜愈合的功效，而青黛則通過作用于腸道菌群，促使腸道黏膜實(shí)現(xiàn)不同程度的修復(fù)，促使腸內(nèi)細(xì)菌的發(fā)生發(fā)展受到抑制，進(jìn)而降低其病情進(jìn)一步惡化風(fēng)險(xiǎn)[13]。另外，本研究也經(jīng)不良反應(yīng)觀察證實(shí)兩組不良反應(yīng)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，經(jīng)現(xiàn)代病理學(xué)證實(shí)，青黛具有抑制炎性反應(yīng)、改善免疫細(xì)胞水平的作用，通過青黛對(duì)多種細(xì)胞功能進(jìn)行調(diào)節(jié)能使得受損的TGF-β1/Smad 3信號(hào)通路得到恢復(fù)，從而使得患者病情得到改善，這個(gè)過程并不會(huì)明顯增加患者不良反應(yīng)，因而具有良好安全性[14]。

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，治療后兩組TGF-β1、Smad 3protein及mRNA表達(dá)均高于治療前，且觀察組均高于對(duì)照組，提示青黛可能通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad 3信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)IBD的治療。目前研究認(rèn)為TGF-β1可以在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化和遷移過程中促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的改善，從而降低炎癥性腸病的惡性病變風(fēng)險(xiǎn)。TGF-β1/Smad 3信號(hào)通路則被認(rèn)為是介導(dǎo)上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要路徑，當(dāng)TGF-β1受損后經(jīng)由信號(hào)傳導(dǎo)可能使得Smad表達(dá)改變，從而使得該信號(hào)通路的正常運(yùn)轉(zhuǎn)受到影響，通過服用青黛能促進(jìn)TGF-β1/Smad 3信號(hào)通路的修復(fù)和完善，同時(shí)使得炎癥反應(yīng)受到抑制，并促進(jìn)黏膜的修復(fù)，具有較高的應(yīng)用意義[15-17]。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)觀察組CD3+、CD4+水平均高于對(duì)照組，CD8+水平低于對(duì)照組，提示青黛可以通過改善TGF-β1/Smad 3信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)患者體內(nèi)免疫因子水平的改善。服用青黛后可能對(duì)炎癥細(xì)胞產(chǎn)生明顯破壞作用，從而使得患者免疫能力明顯增強(qiáng)，更好地發(fā)揮對(duì)于殘余炎癥細(xì)胞的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移的抑制作用，故而具有良好的應(yīng)用價(jià)值[18-21]。

綜上所述，青黛用于炎癥性腸病患者可以獲得良好的臨床效果，且可能通過修復(fù)TGF-β1/Smad 3信號(hào)通路促使患者免疫水平提升，進(jìn)而使得病情癥狀得到改善，且安全性良好，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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