非洲豬瘟基因I 型/II 型重組病毒研究現(xiàn)狀及思考

戈勝強，沙 洲，鄭 輝，劉春菊，左媛媛，胡永新，王曉華，劉 爽，魏 榮，王志亮

（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；2. 青島市現(xiàn)代生物工程及動物疫病研究重點實驗室，山東青島 266032；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生物安全風險預警及防控重點實驗室（南方），山東青島 266032）

2018 年非洲豬瘟（African swine fever，ASF）傳入我國后，在國內持續(xù)流行蔓延，目前疫情數(shù)量雖然大幅下降，但其病原已在我國定殖并形成較大污染面，疫情發(fā)生風險依然較高。我國最早傳入的非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）為China 2018/1 株[1]（后重新命名為China/LN/2018/1[2]），是基因II 型毒株。隨后相關研究機構在相近時間內分離到了pig/HLJ/18 株[3]和SY18 株[4]，其均為基因II 型毒株。這些分離株與2007 年傳入格魯吉亞的Georgia 2007 毒株[5]高度相似，致死率最高可達100%。2021 年國內報道發(fā)現(xiàn)基因I 型HeN/ZZ-P1/21 株和SD/DY-I/21 株，該類毒株仍具有一定毒力和水平傳播能力，且組織臟器中病毒拷貝檢測Ct 值達25 左右[6]。基因I 型和II 型毒株在同一區(qū)域內流行，過去只在非洲部分國家[7]和意大利撒丁島[8]等區(qū)域發(fā)生。國外研究者曾報道過ASFV 重組毒株，但發(fā)生基因I 型和II 型重組的未見報道。2021 年以來，國內研究者在江蘇省（Jiangsu/LG/2021 株，JS/LG/21）、河南省（Pig/Henan/123014/2022 株，HeN/123014/22）和內蒙古自治區(qū)（Pig/Inner Mongolia/DQDM/2022株，IM/DQDM/22）相繼發(fā)現(xiàn)基因I 型/II 型重組毒株[9]，這是世界范圍內首次報道此類相關重組毒株。目前，關于ASFV 重組毒株的國內外研究較少，尚缺乏系統(tǒng)的專業(yè)闡述，為此就相關研究進展進行總結歸納，以期為我國ASF 防控提供參考。

1 ASFV 重組研究現(xiàn)狀

基因重組是許多病毒進化的重要驅動力[10]。基因重組事件通常發(fā)生在序列高度相似的病毒之間[11]，特別是DNA 病毒，如在ASFV、皰疹病毒（herpesviruses）、腺病毒（adenoviruses）、痘病毒（poxviruses）、雙生病毒（geminiviruses）等病毒中均觀察到重組現(xiàn)象[12-14]。值得注意的是，根據(jù)有限的基因組序列識別重組事件并非易事[15-16]。早期的ASFV 重組研究因缺乏足夠完整的病毒基因組序列，只能對其進行相對簡單的單基因重組分析。例如，16 株意大利分離株和1 株南非分離株的E183L基因（編碼p54 蛋白）經(jīng)RDP3 軟件分析存在相似的重組事件，推測這些毒株來源于同一個重組毒株[17]。相似的，ASFV的多基因家族（MGF）以及B602L、EP153R和EP402R（編碼CD2v 蛋白）等基因也存在重組事件[18]。例如，格魯吉亞2007分離株（Georgia 2007/1）的EP402R基因與非洲馬拉維分離株（Malawi Lil20/1）和肯尼亞分離株（Kenya 1950）相近，而其EP153R基因與疣豬分離株相近[19-20]。進一步的研究[21]顯示，EP153R和EP402R基因的重組，促進了ASFV 血清型特異性位點進化，有利于病毒的進化生存。2019 年Peng等[22]對39 株ASFV 全基因組序列（包含多種基因型）分析發(fā)現(xiàn)，ASFV 基因組間存在廣泛的同源重組，而同源重組是造成ASFV 遺傳多樣性的主要原因。2023 年Bao 等[23]進一步對41 株基因II 型ASFV 進行了遺傳追溯研究，也證實了重組現(xiàn)象存在于基因II 型分離株中。

ASFV 發(fā)生重組必須滿足以下條件：一是病毒基因組中存在大量重復序列并在病毒復制過程中發(fā)生基因替換等重組現(xiàn)象（此基因組特征已被廣泛證實[24]）；二是多株毒株共同感染（較高感染劑量）同一頭豬，不同毒株間發(fā)生基因重組。臨床中，雙重感染（dual infections）、共同感染（co-infection）、重復感染（superinfections）在病毒感染宿主過程中并不罕見[25]。但實際上在ASF 流行歷史中，流行毒株相對單一，因而發(fā)生雙重感染的事件并不是很多。如莫桑比克在1960 年至1994 年間，存在同一疫情暴發(fā)期間兩個基因型毒株共同傳播，但并未發(fā)現(xiàn)共同感染的證據(jù)[26]。這其中的原因也可能是當時的鑒別診斷方法并不先進。如果某個地域存在多種毒株流行，就存在一定的雙重感染發(fā)生概率。2017 年，Mulumba-Mfumu 等[27]在追溯研究中首次報道，在2005 年的同一份豬病料中分離到2 株基因I 型ASFV 毒株，在2010 年的疫情中分離到兩個基因型毒株（基因I 型和基因XIV）。相似的，2021 年，F(xiàn)iori 等[28]進行了ASFV 追溯性研究，從1984 年的野豬樣品和2018 年的家豬樣品中均發(fā)現(xiàn)了雙重感染證據(jù)。鑒于檢測雙重感染的診斷技術具有一定難度，同時該研究在不到100 個樣本中就發(fā)現(xiàn)有兩種不同的雙重感染，這有力說明了ASFV雙重感染在意大利撒丁島可能是相對常見事件，這可能與該地區(qū)ASFV 流行率高和多種毒株共同流行的現(xiàn)狀緊密相關。

2 我國基因I 型/II 型重組毒株研究現(xiàn)狀

2021 年國內報道的基因I 型毒株（HeN/ZZP1/21 株和SD/DY-I/21 株）均無紅細胞吸附活性（HAD-）[6]，這是國內基因I 型毒株最具代表的生物學特征之一。基因分型（I 型或II 型）由B646L基因（編碼p72 蛋白）序列決定，紅細胞吸附活性由EP402R基因（編碼CD2v 蛋白）序列的完整性決定。因此，當研究者發(fā)現(xiàn)國內新分離基因I 型毒株具備紅細胞吸附活性（HAD+）時，會首先聯(lián)想到其B646L和EP402R基因發(fā)生了組合變化。基因I 型/II 型重組毒株（JS/LG/21、HeN/123014/22和IM/DQDM/22）可簡單定義為，B646L基因來自于基因I 型，EP402R基因來自于基因II 型。但全基因組序列分析顯示，該毒株的重組復雜程度遠超之前國內外的其他所有重組分離株。根據(jù)基因I型和II 型ASFV 的特異性單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）分析，基因I 型/II 型重組毒株的全基因組序列可被拆分為20 個大的基因片段（F1—F20），其中10 個片段來源于基因I 型毒株（基因I 型相似率為99.36%～100%，基因II 型相似率低至71.28%～99.15%）， 另外10 個片段來源于基因II 型毒株（基因II 型相似率為99.95%～100%，基因I 型相似率低至27.50%～98.32%）。

基因I 型/II 型重組毒株毒力評價顯示，該毒株的毒力與基因II 型強毒株（pig/HLJ/18）相當，某些致病指標甚至更高。如基因II 型強毒株（pig/HLJ/18）以106.5HAD50劑量攻毒后，最早在第6天出現(xiàn)感染豬死亡[3]；而基因I 型/II 型重組毒株（JS/LG/21）以更低的106HAD50劑量攻毒后，最早在第5 天出現(xiàn)感染豬死亡。此外，該毒株可逃避基因II 型減毒活疫苗株（HLJ/18-7GD）[29]誘導的免疫保護，即對HLJ/18-7GD 免疫接種豬（肌肉注射，106TCID50）進行JS/LG/21 攻毒（肌肉注射，103TCID50），結果發(fā)現(xiàn)所有豬均在第10 天死亡。

之前也有類似ASFV 大片段重組的報道，重組區(qū)域最大為20 010 bp[30]，但像JS/LG/21 這樣，僅以基因I 型和II 型基因序列為來源，不同長度片段（重組區(qū)域占比為1%～24%）交替重組的尚屬首次發(fā)現(xiàn)，其基因組序列在某種意義上更近似基因I型/II 型嵌合基因組（mosaic genomes of genotype I and genotype II）的樣貌。再加上基因II 型減毒活疫苗株不能對該毒株產(chǎn)生有效保護，結合ASFV 不同基因型間普遍存在交叉保護差的問題，這似乎也佐證了該毒株具備了基因I 型和II 型的雙重特性，在生物學特性上具備了嵌合病毒的一些特征。該毒株在國內的流行演變可能會顯著影響ASFV 的進化方向，并提示以基因II型為研究對象的疫苗半成品，將面臨新的研制挑戰(zhàn)。

3 結語

過去研究認為，ASFV 在疣豬和軟蜱中的長期持續(xù)感染可能為不同基因型毒株的共同感染及隨后的基因重組提供了機會[31]。但由于鑒別診斷和全基因測序分析技術的滯后及流行毒株單一等，在東歐國家以及俄羅斯流行的基因II 型毒株（Georgia 2007 株來源）未出現(xiàn)重大的重組事件[21]。而我國分離的基因I 型/II 型重組毒株，因嵌合了兩個基因型序列并部分整合了二者的生物學特性，使得我國流行分離株增加了新的分支。在原有基因II 型強毒株、基因I 型中等毒力毒株、基因II 型缺失株/變異株等共同流行的背景下，新出現(xiàn)的基因I型/II 型重組毒株可能會進一步“擾亂”現(xiàn)有毒株的進化方向，加速毒株向復雜化、差異化變異。但同時，基因I 型/II 型重組毒株，也會沿襲病毒演化規(guī)律[32]，經(jīng)臨床不斷“馴化”后演變出毒力致弱的相關毒株，提示我國ASF防控形勢將更加復雜。

此外，現(xiàn)有絕大多數(shù)核酸檢測方法是針對B646L基因保守區(qū)，因此對于鑒定基因I 型/II 型重組毒株仍有效，但過分強調鑒別檢測能力的新方法（特別是多重qPCR 方法），雖可對當前流行毒株進行鑒別檢測，但伴隨著毒株變異可能加速，變異方向不確定等因素，可能存在新研制檢測方法很快失效的困境，需加以重視和區(qū)分。