兒童過(guò)敏性紫癜口腔菌群及其代謝產(chǎn)物特征

王晴雯 張淑雅 熊維霖 胡曉磊 李紫薇 郭慶寅

1河南中醫(yī)藥大學(xué) （鄭州 450003）；2河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 （鄭州 450003）

過(guò)敏性紫癜（HSP）是兒童最常見的系統(tǒng)性小血管炎，30% ～ 50%的HSP 會(huì)進(jìn)展為過(guò)紫癜性腎炎（HSPN）［1］，少數(shù)進(jìn)展為終末期腎?。?］。HSP 的主要觸發(fā)因素是黏膜感染［3］，尤其是呼吸道黏膜［4］。黏膜菌群組成和代謝產(chǎn)物與感染密切相關(guān)［5-6］。之前的研究中沒(méi)有結(jié)合代謝產(chǎn)物，且未將這二者關(guān)聯(lián)起來(lái)。因此，本研究以唾液為研究樣本通過(guò)16S rRNA 測(cè)序與代謝組學(xué)相結(jié)合的方法，整合探究HSP 的發(fā)病機(jī)制，為臨床研究提供新的診斷與治療方向。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院2022 年1 - 7 月兒科收治的初發(fā)HSP 患兒20 例、初發(fā)HSPN 患兒20 例，同時(shí)征集20 例健康正常兒童作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：各組年齡為5 ～ 12 歲；病程＜ 4周者。HSP患兒符合《兒童過(guò)敏性紫癜循證診治建議》［7］診斷標(biāo)準(zhǔn)。HSPN 患兒符合《紫癜性腎炎診治循證指南》［8］診斷標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組為同期在我院體檢的健康兒童。排除標(biāo)準(zhǔn)：2 周前使用激素、免疫抑制劑、微生態(tài)制劑治療者；心腦血管、肺臟等臟器嚴(yán)重病變及精神疾病者；過(guò)敏性鼻炎、鼻竇炎、齲齒和其他口腔疾病患者。所有參與兒童的監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書；該研究已得到河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（編號(hào)：2020HL-101-01）。因16S rRNA測(cè)序中HSPN組1例樣品質(zhì)量不合格而排除。各組臨床特征差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），見表1。

表1 各組人口學(xué)基線特征比較Tab.1 Comparison of demographic baseline characteristics among groups ±s

表1 各組人口學(xué)基線特征比較Tab.1 Comparison of demographic baseline characteristics among groups ±s

項(xiàng)目性別（例）男女年齡（歲）身高（cm）體質(zhì)量（kg）對(duì)照組（n = 20）14 6 8.10 ± 1.89 132.25 ± 7.23 30.75 ± 4.89 HSP組（n = 20）13 7 7.35 ± 2.16 127.15 ± 10.70 28.65 ± 4.83 HSPN組（n = 19）11 8 8.74 ± 2.28 130.37 ± 8.25 31.79 ± 8.54統(tǒng)計(jì)值0.210 1.931 1.446 1.364 P值0.895 0.132 0.236 0.260

1.2 標(biāo)本采集 采集唾液前2 h 內(nèi)禁食，收集唾液3 ～ 5 mL。離心后置于-80 ℃超低溫冰箱。

1.3 16S rRNA 測(cè)序 采用特異性引物擴(kuò)增16S rRNA/18S rRNA/ITS 基因。用Qiagen Gel Extraction Kit（Qiagen）純化PCR 產(chǎn)物，應(yīng)用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit（Illumina）構(gòu)建文庫(kù)，于Illumina NovaSeq6000 平臺(tái)系統(tǒng)上機(jī)測(cè)序，最后對(duì)OTU 序列進(jìn)行物種注釋，豐富度（Chao1、Observed_species）及多樣性（Simpson 指數(shù)），PCoA 降維分析，LDA 效應(yīng)量及ANOSIM 和MRPP 分析。

1.4 代謝組學(xué)多元數(shù)據(jù)分析 經(jīng)過(guò)代謝物提取，采用超高效液相色譜儀及液相色譜柱進(jìn)行色譜分離，最后采用軟件Simca（V16.0.2）對(duì)數(shù)據(jù)處理和分析。采用正交偏最小二乘判別分析來(lái)分析結(jié)果。差異代謝物的篩選卡值標(biāo)準(zhǔn)是studentt檢驗(yàn)。采用京都基因與基因組百科全書（KEGG）的通路數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html）篩選通路，找到與HSP 中各組之間差異性代謝物相關(guān)的關(guān)鍵通路。

1.5 相關(guān)性分析 對(duì)從唾液16S rRNA 測(cè)序中篩選出的菌屬和從唾液代謝組學(xué)中篩選出的差異性代謝產(chǎn)物進(jìn)行Spearman 相關(guān)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件。符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料，采用t檢驗(yàn)分析組間差異；不完全符合正態(tài)分布或方差不齊的計(jì)量資料，采用兩獨(dú)立樣本W(wǎng)ilcoxon 秩和檢驗(yàn)。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

未加權(quán)和加權(quán)的UniFrac 距離，使用PCoA 評(píng)估了3 組之間β 多樣性，并區(qū)分菌群結(jié)構(gòu)組間差異。采用基于秩檢驗(yàn)的LEfSe分析（LDA評(píng)分＞ 4）及t檢驗(yàn)區(qū)分各組的口腔菌群。t檢驗(yàn)區(qū)分各組的口腔差異代謝產(chǎn)物，氣泡圖顯示各組口腔差異代謝通路。Spearman 相關(guān)分析菌群和代謝產(chǎn)物間的相關(guān)性。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 口腔菌群的豐富性和多樣性 HSPN組豐富度高于HSP組，而多樣性顯著低于HSP組（P＜ 0.05）；HSPN 組豐富度高于對(duì)照組，而多樣性顯著低于對(duì)照組（P＜ 0.05）；HSP 組豐富度和多樣性低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表2。

表2 各組豐富度和多樣性比較Tab.2 Comparison of richness and diversity among groups ±s

表2 各組豐富度和多樣性比較Tab.2 Comparison of richness and diversity among groups ±s

組別HSPN組HSP組健康對(duì)照組Chao1 880.85 ± 420.40 478.94 ± 253.91 508.97 ± 256.70 Observed_species 686.68 ± 328.06 387.40 ± 153.15 424.55 ± 195.32 Simpson 0.897 ± 0.059 0.930 ± 0.018 0.937 ± 0.022

2.2 口腔菌群的特征 比較3 組之間門到屬水平的口腔菌群相對(duì)豐度在前10 的菌群。門水平的菌群組成表明，F(xiàn)irmicutes（厚壁菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）和Fusobacteriota（梭桿菌門）在各組中均為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門，占總序列所有菌群的90%以上。屬水平上，Streptococcus（鏈球菌屬）、Prevotella（普雷沃氏菌屬）和Neisseria（奈瑟氏菌屬）在四組中均為優(yōu)勢(shì)菌屬，三者總和占所有菌群的40%以上，鏈球菌屬最為豐富，見圖1。

圖1 各組菌群相對(duì)豐度及OTUs 的比較Fig. 1 Comparison of relative abundance of flora and OTUs in each group

2.3 口腔菌群的結(jié)構(gòu) PCoA 結(jié)果表明，各組菌群都有較強(qiáng)的聚集性，見圖2。并分析口腔菌群結(jié)構(gòu)組間差異，見表3。

圖2 各組之間菌群的PCoA 分析Fig. 2 PCoA analysis of flora between groups

表3 口腔菌群結(jié)構(gòu)組間差異分析Tab. 3 Analysis of differences between oral flora structure groups

2.4 口腔菌群差異分類豐度 LEfSe 分析結(jié)果表明在屬水平上，HSPN 組中假單胞菌屬顯著高于HSP 組和對(duì)照組（P＜ 0.05），見圖3。HSPN 組中假單胞菌屬和Parabacteroides（副擬桿菌屬）顯著高于HSP 組和對(duì)照組（P＜ 0.05），見圖4。

圖4 t 檢驗(yàn)確定HSPN 組與HSP 組及對(duì)照組間的屬水平差異物種Fig. 4 Species with genus level difference between HSPN group， HSP group and control group determined by t-test

2.5 口腔代謝產(chǎn)物分析 HSPN 組與HSP 組對(duì)比，見表4。HSPN 組與對(duì)照組對(duì)比，見表5。HSP組與對(duì)照組對(duì)比，未篩選出主要的差異性代謝產(chǎn)物，無(wú)代謝通路。

表4 HSPN 組與HSP 組差異性代謝途徑的篩選結(jié)果Tab.4 Screening results of differential metabolic pathways between HSPN group and HSP group

表5 HSPN 組與對(duì)照組差異性代謝途徑的篩選結(jié)果Tab.5 Screening results of different metabolic pathways between HSPN group and control group

2.6 口腔代謝通路分析 HSPN 組與HSP 組對(duì)比，苯丙氨酸代謝通路尤為顯著；HSPN 組與對(duì)照組對(duì)比，苯丙氨酸代謝通路尤為顯著，見圖5。HSP 組與對(duì)照組對(duì)比，無(wú)代謝通路。

圖5 組間代謝通路分析Fig. 5 Analysis of metabolic pathways between groups

2.7 口腔菌群與代謝產(chǎn)物的相關(guān)性分析 HSPN

組與HSP 組中假單胞菌屬、副擬桿菌屬與苯丙氨酸代謝途徑產(chǎn)物呈負(fù)相關(guān)；HSPN 組與對(duì)照組中假單胞菌屬、副擬桿菌屬與苯丙氨酸代謝途徑產(chǎn)物呈負(fù)相關(guān)，見表6、7。其中苯丙氨酸代謝途徑產(chǎn)物包括2-羥基肉桂酸、苯丙酮酸、N-乙?；?L-苯丙氨酸。

表6 HSPN 組與HSP 組間口腔菌群與代謝產(chǎn)物的相關(guān)性Tab.6 Correlation between oral flora and metabolites between HSPN group and HSP group

表7 HSPN 組與健康對(duì)照組組間口腔菌群與代謝產(chǎn)物的相關(guān)性Tab. 7 Correlation between oral flora and metabolites between HSPN group and healthy control group

3 討論

已有研究表明，HSP 與口腔中的菌群的豐富度和多樣性有關(guān)。PANG 等［6］發(fā)現(xiàn)，HSPN 患兒舌苔上的菌群豐富度和多樣性明顯低于健康對(duì)照組，此結(jié)果與本研究結(jié)果一致?？谇痪弘S著唾液吞咽定植在消化道，口腔和腸道中的菌群與疾病狀態(tài)有關(guān)系［5，9-10］。而且研究［11-12］表明，腸道和口腔菌群之間出現(xiàn)一致性，表明不同身體部位物種的豐度和功能存在重疊。與對(duì)照組相比，HSPN組兒童在口腔菌群中表現(xiàn)出更低的多樣性這與既往在腸道菌群中的發(fā)現(xiàn)部分一致，更趨近腸道菌群的失衡；與對(duì)照組相比，HSP 組兒童在口腔菌群結(jié)構(gòu)組成差異不明顯和多樣性差異不大，這可能是無(wú)腎臟損傷的HSP 菌群失調(diào)不明顯。這與既往研究在腸道菌群中的發(fā)現(xiàn)不同，后者表明患有HSP 的兒童中α 多樣性減少，結(jié)構(gòu)組成差異明顯［11-12］。且ZHOU等［14］發(fā)現(xiàn)，HSP或HSPN兒童表現(xiàn)出腸道微生物群多樣性差異顯著。

在本研究中，α 多樣性分析表明了HSP 發(fā)病與口腔中的菌群有關(guān)。且HSPN 比無(wú)腎臟損傷的HSP 菌群失調(diào)更加明顯。相比于健康兒童，HSP初發(fā)期患兒口腔菌群的整體變化小，這可能是患兒發(fā)病后短時(shí)間內(nèi)口腔菌群因時(shí)間較短還未出現(xiàn)明顯改變?？谇晃⑸飬^(qū)系屬水平上組成差異，與健康兒童和HSP 相比，HSPN 患兒中鏈球菌屬升高但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，假單胞菌屬和副擬桿菌屬差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鏈球菌是口腔群落的優(yōu)勢(shì)屬之一，也是存在的口腔潛在病原體菌群。鏈球菌水平越高的HSPN 患者更容易出現(xiàn)血尿和低蛋白血癥，且HSPN 患者腸道微生物群失調(diào)明顯，腸黏膜鏈球菌感染明顯，與嚴(yán)重程度密切相關(guān)［15］。已知嗜血桿菌屬與鏈球菌屬是競(jìng)爭(zhēng)共存關(guān)系，兩者只有一種細(xì)菌占優(yōu)勢(shì)［16］。假單胞菌屬在腸道和口腔多樣性降低與多種自身免疫性疾病相關(guān)［17］。鏈球菌屬和假單胞菌屬的細(xì)菌通過(guò)分泌胞外多糖等物質(zhì)形成的生物被膜附著在黏膜表面，引起黏膜感染［17］。副擬桿菌屬是傳染病中的機(jī)會(huì)致病菌屬，能夠產(chǎn)生抗菌藥物耐藥性。已有研究［13］表明，Parabacteroidesspp.豐度與腸道通透性相關(guān)的主要緊密連接蛋白（occludin 和ZO-1）的結(jié)腸mRNA 水平呈負(fù)相關(guān)，HSPN 患者的腸道通透性增加。鏈球菌屬、假單胞菌屬、副擬桿菌屬這3 種菌屬的相對(duì)豐度增加可能與HSPN 發(fā)病相關(guān)。與HSP 組相比，HSPN 組菌群結(jié)構(gòu)組成變化明顯且多樣性降低，這表明HSPN 致病菌群增多且增殖更快，菌群出現(xiàn)明顯的紊亂，HSPN 進(jìn)展較迅速且嚴(yán)重。

通過(guò)代謝組學(xué)和代謝通路研究分析表明，HSPN 組與HSP 組及對(duì)照組間的口腔代謝產(chǎn)物有明顯的差異，主要集中于苯丙氨酸代謝相關(guān)的代謝產(chǎn)物，如2-羥基肉桂酸、苯丙酮酸、N-乙酰基-L-苯丙氨酸，這與本研究中的差異性菌群有相關(guān)性。本研究結(jié)果表明，假單胞菌屬、副擬桿菌屬與苯丙氨酸代謝途徑產(chǎn)物呈負(fù)相關(guān)。其中N-乙酰-L-苯丙氨酸可由細(xì)菌中生物酶催化L-苯丙氨酸和乙酰輔酶A 合成，在微生物中對(duì)防御、運(yùn)動(dòng)和代謝很重要，可在細(xì)菌爭(zhēng)奪有限資源的斗爭(zhēng)中作為抗菌藥物［18］。2-羥基肉桂酸是一種鄰香豆酸，具有抗氧化和抗菌等生物活性。它是由細(xì)菌通過(guò)代謝苯丙氨酸解氨去氧產(chǎn)生的［19］。苯丙酮酸能顯著降低葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性，引起NADPH 產(chǎn)生的損害并最終改變細(xì)胞氧化還原狀態(tài)［19］。這3 種物質(zhì)產(chǎn)生減少，口腔的抗氧化和抗菌環(huán)境減少的變化表明優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)減少，潛在致病菌相對(duì)增加。由此推測(cè)，苯丙氨酸代謝的產(chǎn)物2-羥基肉桂酸、苯丙酮酸、N-乙?；?L-苯丙氨酸可作為HSPN 發(fā)病過(guò)程中的代謝產(chǎn)物。

在本研究中，通過(guò)使用16S rRNA 測(cè)序和代謝組學(xué)方法分析不同類型的HSP 患兒唾液樣本中的細(xì)菌物種和代謝產(chǎn)物。這一研究表明HSP 的發(fā)病可能與口腔微生態(tài)的失調(diào)相關(guān)。唾液樣本中屬水平上鏈球菌屬、假單胞菌屬、副擬桿菌屬優(yōu)勢(shì)可能作為HSPN 發(fā)病的觸發(fā)因素之一，苯丙氨酸代謝可能是HSPN 發(fā)病過(guò)程中的通路之一。這為臨床診斷HSP 疾病提供了指導(dǎo)，并且為臨床治療HSP 疾病提供新思路和新切入點(diǎn)。

【Author contributions】WANG Qingwen performed the experiments and wrote the article. GUO Qingyin designed the study and revised the article. ZHANG Shuya and LI Ziwei performed part of the experiments. XIONG Weilin， HU Xiaolei revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.