自噬調控小膠質細胞極化在缺血性腦卒中的研究進展

王方明 尚文璇 張靖雯 吉盈肖 李俐濤

1河北醫科大學研究生院（石家莊 050017）；2河北北方學院研究生院（河北張家口 075000）；3河北省人民醫院神經內科（河北省腦網絡與認知障礙疾病重點實驗室）（石家莊 050051）

缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）是我國臨床最常見的腦血管疾病，約占所有腦血管疾病的75%，致殘率極高［1］。目前IS缺乏理想的治療方法，盡管靜脈溶栓治療及機械取栓手術可改善完全性腦卒中患者的預后，但這些治療方法存在溶栓時間窗有限、再灌注損傷及再出血并發癥等問題，使患者面臨繼發性腦損傷的高風險。大量研究表明炎癥在繼發性腦損傷中起到關鍵的級聯損傷作用［1］，而且小膠質細胞在參與IS 后炎癥反應時，可被激活成兩種表型—經典激活型（M1 表型）和替代激活性（M2 表型）［2］，其中M1 型和M2 型小膠質細胞分別發揮著促炎和抗炎作用，將小膠質細胞從M1 型轉化為M2 型，可以挽救梗死周圍的缺血半暗帶，促進恢復期神經血管單元重構，所以調節小膠質細胞從M1 到M2 轉化是阻止繼發性腦損傷的重要途徑。研究證實，自噬（autophagy）可調節小膠質細胞的表型轉化［3］。本文就自噬對小膠質細胞表型變化的影響在IS 的研究進展進行綜述。

1 小膠質細胞極化與自噬概念

1.1 小膠質細胞極化 神經系統炎癥反應在IS中發揮重要作用，其中小膠質細胞是中樞神經系統的主要免疫反應細胞。在感染、外傷或缺血后，小膠質細胞可被迅速激活，調節炎癥反應。小膠質細胞被激活后可分化為兩種表型—M1 型和M2型。其中，M1 型細胞可由細菌脂多糖（LPS）誘導產生，其表面表達CD86、CD68 等，并可以分泌大量炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素β（IL-β）、人干擾素-γ（INF-γ）和NO 等；M2 型細胞可由IL-4/IL-10 誘導產生，促使小膠質細胞分泌IL-4、精氨酸酶1（arignase1）、幾丁質酶樣蛋白質（Ym1）、CD206 及IL-1，前者促進腦缺血后二次損傷，而后者具有腦缺血后的神經保護作用［4］。HU等［5］基于線栓法阻塞C57BL/6J 小鼠左側大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA），通過建立局灶性腦缺血模型，并利用PCR 技術觀察到M2 型小膠質細胞標志物（CD206、Arg1、CCL22、Ym1/2、IL-10 和TGF-β）的mRNA 在大腦中動脈栓塞后1 ～ 3 d 開始表達，并于3 ～ 5 d 達到高峰，7 d 開始下降，14 d恢復到損傷前水平。然而，M1 型小膠質細胞相關基因（iNOS、CD11b、CD16、CD32、CD86）的水平從術后第3 天開始逐漸升高，14 d 達到高峰。IS 后小膠質細胞M1/M2 型表達模式的動態變化早期表現出有益的M2 表型，后期轉變為有害的M1 表型。調節小膠質細胞從M1 表型向M2 表型轉化可能是治療IS 的關鍵方法。

1.2 自噬概念 自噬是細胞內分解代謝的一種途徑，是受自然調控的過程，可消除細胞內功能失調的成分［6］。其分類方式多樣，根據向溶酶體運輸貨物方式的不同，可分為3 種，巨自噬、微自噬、分子伴侶介導型自噬。巨自噬即由內質網、線粒體、高爾基體或細胞質膜等來源的膜包繞待降解物形成自噬體，然后與溶酶體融合降解相應底物；微自噬指溶酶體膜自身發生凹陷，直接包裹和吞噬細胞內待降解的底物，并在溶酶體內降解；分子伴侶介導的自噬是由分子伴侶蛋白識別并結合帶有特定氨基酸序列的可溶性蛋白質，經溶酶體膜上受體轉運到溶酶體內，隨后被水解酶降解的過程［7］。除此之外，自噬的過程可分為3 個階段，包括降解的細胞質成分被雙層膜吞噬形成自噬小體、自噬小體與溶酶體融合、水解酶催化降解其內容物［8］，自噬調節劑可作用于其中某個階段發揮調節作用。

自噬受多種信號分子調控，這些信號分子包括哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase， MAPK）、5′-AMP 活化蛋白激酶（AMPK）、蛋白激酶B（Akt）、Beclin-1、p53、Rab7 等［9-10］。Beclin1、LC3 和P62 是反映自噬水平的關鍵指標。Beclin1 與PI3K 結合形成復合物，招募自噬相關蛋白，參與自噬起始過程［11］。LC3 有LC3I 和LC3II 兩種形式，由LC3I 向LC3II 轉化是自噬體膜形成的關鍵步驟［12］。P62 蛋白作為自噬降解底物的受體，其累積表示自噬過程的抑制，與自噬水平呈負相關［13］。Beclin1、LC3 水平增多，P62蛋白水平減少代表自噬激活，相反代表自噬抑制［14］。尋找自噬信號靶點，發揮自噬調節作用將是一種潛在治療方式。

2 自噬調控小膠質細胞極化的研究進展

自噬作為應激條件下的生存機制，在炎癥及免疫系統調節方面發揮重要作用［15］。研究發現，在IS 中，自噬抑制劑3-Ma 及mTORC1 抑制劑西羅莫司等干預后，自噬標記物及蛋白發生改變，小膠質細胞極化狀態也隨之改變［16］，提示自噬可介導小膠質細胞的極化，進而影響IS 炎癥反應進程，該通路相關基因成為IS 潛在的新治療靶點，如圖1所示。目前研究表示，自噬調節小膠質細胞向兩方向極化，探究自噬對小膠質細胞的具體調節靶點，發揮其調節作用，進而促進小膠質細胞向抗炎型轉化成為臨床獲益關鍵。

圖1 自噬調節小膠質細胞極化過程Fig.1 The process of microglia polarization regulated by autophagy

2.1 自噬促進小膠質細胞向M1 極化 自噬調控小膠質細胞向M1 表型的轉化，加劇腦缺血損傷。外泌體具有免疫原性低、穩定性好等特點且易通過血腦屏障，其可調控小膠質細胞自噬作用進而影響極化方向，為目前IS 研究提供新靶點。JIANG 等［16］應用富含MIR-30d-5p 的外泌體處理缺血缺氧的小膠質細胞，檢測到自噬相關蛋白Beclin-1 等表達減少，TNF-α 等炎癥因子下降，IL-4和IL-10 增加，進一步使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-Ma）處理小膠質細胞，細胞上清液中促炎因子表達下降，抗炎因子表達增加，證明自噬調控小膠質細胞向M1 極化，且富含MIR-30d-5p 的外泌體可抑制自噬作用。

Toll 樣受體（TLR）在中樞神經系統的多種細胞類型中高表達，是機體與環境之間的第一個接觸點。因此，特異性調節TLR 的活性或表達可以預防炎癥相關疾病的發展。TLR4 依賴性小膠質細胞自噬可通過STAT1/6 通路調控小膠質細胞向M1 極化。QIN 等［17］行雙側頸動脈狹窄術建立慢性腦灌注模型，發現暴露于LPS 的小膠質細胞內自噬體快速積累，轉錄激活蛋白1（signal transducer and activator of transcription， STAT1）上調及STAT6下調，小膠質細胞M1 型標志物高表達，自噬抑制劑和敲除TLR4 均使小膠質細胞功能從促炎表型轉變為抗炎表型，STAT1 的上調和STAT6 的下調被逆轉。此外，TLR2 介導的小膠質細胞自噬可以調節其向M1 型轉換。MA 等［3］采用肽聚糖（PGN）感染小膠質細胞，聯合應用TLR2 拮抗劑CU-CPT22和激動劑Pam3CSK4 干預細胞，發現與PGN 組相比，PGN+Pam3CSK4組自噬標記物LC3II和Beclin-1表達增加，M2 型標志物被抑制，小膠質細胞明顯向M1 表型轉化，而PGN+CU-CPT22 組觀察到相反的結果，自噬增強伴隨凋亡增加，凋亡程度與M1表型轉換一致。

核因子NF-κB 信號通路與自噬存在密切的相互調控作用，可作為自噬與炎癥共同信號分子，在腦組織炎癥反應中發揮至關重要的作用。NF-κB介導的小膠質細胞自噬作用，可能成為治療IS 的重要靶點。XIN 等［18］發現PM2.5 增加M1 型標志物表達，自噬抑制劑3-MA 與PM2.5 共同處理小膠質細胞后，自噬水平降低，M1 型標志物表達減少，M2 型標志物表達增加，表明自噬抑制劑促進小膠質細胞向M2 型極化，進一步實驗證實自噬可能通過PI3K/AKT/NF-κB 信號通路調節小膠質細胞向M1 極化。

血清CX3C 趨化因子配體1（CX3CL1）是在神經元上表達的膜結合趨化因子，可以通過與小膠質細胞上的受體CX3CR1 結合來抑制小膠質細胞炎癥［19］。神經元自噬通過下調CX3CL1 促進小膠質細胞向M1 極化，HE 等［20］用線栓法建立大腦中動脈阻塞模型，觀察到MCAO 干預組血清CX3CL1陽性比例明顯降低，Iba-1 和NF-κ B 陽性百分比增加，自噬抑制劑3-MA 處理后，神經元上CX3CL1 表達顯著增加，Iba-1 和NF-κ 結果相反。

綜上所述，自噬可促進小膠質細胞向促炎型M1 極化，進而加重腦組織損傷程度。外泌體、NFκB 信號分子、Toll 樣受體等在未來可能作為調節自噬的靶點，為缺血性腦卒中的治療提供新思路。

2.2 自噬促進小膠質細胞向M2 極化 自噬在促進小膠質細胞向M2 型轉化方面也發揮重要作用。mTOR 可分為兩種類型，mTOR 復合物1（mTORC1）和mTOR 復合物2（mTORC2）［21］。mTORC1 信號傳導抑制自噬過程，其磷酸化減低可作為自噬激活標志物。LI 等［22］基于線栓法建立MCAO 模型，將mTORC1 抑制劑西羅莫司和依維莫司經口灌入小鼠胃中，小鼠腦內小膠質細胞CD16/32 和Iba-1雙染的數量明顯減少，通過基因鼠雜交方法阻斷mTORC1 相關蛋白，小鼠腦內M1 型小膠質細胞的基因表達下降，M2 型mRNA 的表達顯著增加，為說明小膠質細胞自噬調節其向M2 極化提供實驗依據。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）是葡萄糖和脂質代謝、細胞器分化及炎癥反應的主要調節劑［23］，PPARγ 激動劑在應對神經炎癥時發揮神經保護作用［24］。JI 等［25］用PPARγ 拮抗劑T0070907 處理LPS 誘導的小膠質細胞，觀察到小膠質細胞自噬活動增強，M2 型標志物如CD206 等的表達增加，M1 型標志物如CD86 等的表達成減少趨勢。加用LKB1 基因抑制劑根赤殼菌素或對LKB1 基因進行敲除，均可逆轉T0070907 的作用進而抑制自噬標志物的表達，促進小膠質細胞向M1極化，說明拮抗PPARγ 可能通過激活LKB1-AMPK信號通路，改善小膠質細胞自噬同時使其向M2 表型極化。

膜聯蛋白-A1（ANXA1）是膜聯蛋白超家族的37 kDa 成員，參與多種細胞類型中多種細胞功能的調節。中樞神經系統中，ANXA1在小膠質細胞中含量豐富。LI等［26］發現類泛素蛋白修飾分子（small ubiquitin-like modifier， SUMO）修飾的ANXA1 可促進抑制因子激酶IKKα 與自噬受體NBR1 之間的相互作用，增加IKKα 的自噬降解，抑制小膠質細胞中NF-κB 信號通路的激活和促炎介質的產生，導致小膠質細胞向抗炎表型極化。上調小膠質細胞中ANXA1 的SUMO 化可通過小膠質細胞自噬作用調節其向M2 型轉化，減少腦梗死體積。

腦腎素-血管緊張素系統（RAS）參與神經炎癥，是人體衰老過程的主要特征。大腦ACE2/Ang（1-7）/MasR 軸在自噬與神經炎癥之間起關鍵調節作用。DANG 等［27］發現血管緊張素Ang（1-7）促進了ASC 蛋白的自噬反應，減少ASC 分布，而LC3 分布增加，上述結果可被轉入因子FOXO1 的抑制劑AS1842856、氯喹（CQ）完全阻斷，提示抑制FOXO1介導的小膠質細胞自噬通路可消除血管緊張素Ang（1-7）的抗炎作用，使其向M1 極化［28］，同時自噬促進小膠質細胞向M2 極化。

自噬可促進小膠質細胞向M2 型轉化，發揮抗炎作用。其中mTORC1、LKB1-AMPK 信號通路、ANXA1 的SUMO 化及RAS 系統或將成為可干預靶點，為腦卒中的臨床治療提供新方案。

2.3 分析自噬調節小膠質細胞極化 近年來，越來越多研究者發現自噬在小膠質細胞極化中起到雙重作用。自噬對小膠質細胞調節的矛盾作用給研究者帶來了新的思考。IS 后不同時間點自噬發揮不同作用，早期誘導的適應性自噬有利于神經存活，而長時間或者過度自噬將引起神經損傷。因此，研究者對自噬標志物檢測的時間差異可能影響對小膠質細胞極化類型的判斷。除此之外，自噬激活劑及抑制劑的選擇可能影響實驗結果的判斷。在實驗過程中，3-MA 作為自噬抑制劑被廣泛應用，而有研究表明，長時間營養充足的干預環境下，其可發揮自噬促進作用［28］，此時選擇特異性強的自噬調節劑顯得尤為重要。此外實驗動物模型類型不同及干預手段差異，甚至實驗動物種類及性別不同可能影響實驗結果，造成自噬對小膠質細胞極化表型影響的矛盾關系。自噬對小膠質細胞極化的調節機制尚未被完全闡明，需要進一步深入研究。

3 自噬調節劑的應用

目前認為，自噬在腦卒中中扮演著“雙刃劍”的作用，其對小膠質細胞極化的調節成雙向性，因此，通過自噬調節劑調節自噬平衡可成為IS 防治的關鍵。自噬受復雜的信號網絡調控，其上游調節因子主要為TOR 復合物和AMPK 共同調節。自噬調節劑種類多樣，其可經PI3K、AMPK-mTOR 及MAPK 等信號介導發揮調節作用，按照其功能可分為自噬激活劑及自噬抑制劑兩種，如圖2 所示。自噬調節劑的應用可成為治療IS 的一個方向，對其選用以及研究開發顯得尤為重要。

圖2 自噬調節劑的應用Fig.2 Applications of autophagy regulators

雷帕霉素主要通過抑制mTORC1，激活ULK1復合物，促進自噬起始［29］，進而對缺血后神經血管單元進行調控，促進神經保護作用，目前臨床應用有限［30］。異氟醚是一種常見的氣態麻醉劑，常用于神經外科的鎮靜和麻醉，ZHAI 等［31］發現異氟醚通過激活AMPK/ULK1 信號通路增強自噬，進一步抑制NLRP3 炎癥小體炎癥因子的釋放，從而改善CIRI 大鼠的神經功能和認知障礙，對大腦發揮保護作用。然而，對于新生兒和老年患者，異氟醚有神經毒性作用［32］，其在IS 方向的臨床應用受限，具體機制仍需要摸索。HECKMANN 等［33］將Ⅲ類PI3K 抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）加入3T3-L1 脂肪細胞細胞培養，觀察到其顯著降低細胞內LC3-II 的水平，抑制自噬作用。3-MA 抑制缺血誘導的LC3-II 表達的同時，也可通過抑制自噬泡延伸進而抑制小膠質細胞自噬［34］，從而抑制炎癥反應，3-MA 在腦缺血后作用機制及效果尚不明確，目前無相關臨床應用研究［35］。黃芩素是一種從黃芩根部提取的生物活性成分，用于抑制癌細胞增值，減少糖尿病及糖尿病并發癥等［36］，研究表明，其可通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路抑制自噬過程，并通過NF-kB 和MAPK 信號通路抑制小膠質細胞的M1轉化和神經炎癥［37］。另外，芬戈莫德主要用于多發性硬化治療［38］，可作用在自噬起始階段，通過激活mTOR/p70S6K 通路，抑制自噬［39］；長春花堿抑制自噬體與溶酶體的結合，抑制自噬，目前無IS 相關臨床應用；氯喹用于神經膠質瘤的治療［40］，通過抑制溶酶體酸化進而抑制自噬過程［41］。自噬調節劑為IS 治療提供希望，但目前臨床應用有限，缺乏研究數據，尋找自噬調節小膠質細胞極化靶點，應用自噬調節劑調節小膠質細胞向M2 型轉化將是下一步亟待解決的問題。

4 IS 后自噬與炎癥相互作用

自噬通過調控小膠質細胞極化發揮促炎或抗炎作用，同時炎癥也影響自噬過程，如圖3 所示。細胞因子和活性氧（ROS）可通過改變細胞內環境調節自噬，其中Th1 家族細胞因子（IL-2、TNF-α等）誘導自噬產生，Th2 家族細胞因子（IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 等）和抗炎細胞因子抑制自噬作用［42］。病原相關分子模式（PAMP）或損傷相關分子模式（DAMP）可通過識別Toll 樣受體（TLR）、NOD 樣受體（NLR）激發炎癥信號并促進自噬激活［43］。適度自噬通過消除炎癥蛋白和促炎細胞因子來有效抗炎，過度自噬會促進炎癥反應［44］。自噬與炎癥相互聯系，互相制衡，與此同時NF-κB、PPARγ、STAT 家族及TLR、NLR 等發生動態變化，影響小膠質細胞表型轉化方向［45］。腦缺血后自噬與炎癥動態平衡被破壞，小膠質細胞作為其中主要參與細胞發揮著重要調節作用，探索IS 后自噬對小膠質細胞極化調節作用，對減輕缺血后腦損傷有重要價值。

圖3 炎癥、自噬與小膠質細胞極化相互作用關系Fig.3 The interaction between inflammation， autophagy and microglia polarization

5 小結

小膠質細胞表型改變是IS 的潛在致病機制，且研究表明自噬可通過調控小膠質細胞極化，參與IS 誘導的炎癥反應過程。本文概述了自噬對小膠質細胞表型轉化的調控作用，對自噬調節劑進行了總結，并討論了自噬與炎癥相互作用關系。促進小膠質細胞由M1 型向M2 型轉化，對發揮小膠質細胞的神經保護作用，從而治療IS 有重要意義。然而，截止目前自噬在小膠質細胞極化的分子調節機制尚不明確，缺乏對IS 病理學的相關研究，而且現有研究存在不同結論。自噬對IS 過程中小膠質細胞表型轉化機制有待進一步研究。

【Author contributions】WANG Fangming designed and wrote the article； SHANG Wenxuan and ZHANG Jingwen collected the literatures； JI Yingxiao revised the article； LI Litao was responsible for the quality control and revision of the article and was in charge of the overall supervision and management of the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.