基于單細胞測序分析膿毒癥早期血小板數量和功能變化

王仙琦 張斌 張琪 代錚 張錦鑫 梁曉麗 李琳 吳林 劉善收

1空軍軍醫大學第一附屬醫院急診科（西安 710032）；2西安市秦皇醫院急診科（西安 710699）

膿毒癥是因感染引起宿主炎癥反應失調導致危及生命的器官功能障礙，是急診科和重癥醫學科常見且高致死率的病種［1］。全球范圍每年膿毒癥相關死亡病例為1 100萬，占全部死亡人數的19.7%［2］，重癥患者病死率高達55.7%［3］；國內醫院ICU膿毒癥患者病死率達35.5%［4］。最新專家共識強調在膿毒癥早期積極治療預防多臟器功能衰竭［5］，要求醫生認真梳理膿毒癥發病早期的臨床特征，篩選不良預后的高危因素預警危重患者，有效提升膿毒癥治療效果。

膿毒癥早期最顯著的病理特征是固有免疫細胞活化釋放炎癥因子有助于殺滅病原菌，但過度應激時免疫細胞死亡釋放大量損傷分子相關模式（DMAPs）致內皮細胞受損，引起血小板黏附聚集形成微血栓，誘發彌散性血管內凝血（DIC）甚至多臟器功能衰竭［6］。臨床調查發現血小板減少與膿毒癥患者病死率相關［7-8］，此外，血小板還可能介導白細胞功能參與機體免疫應答［9-10］。以前受限于技術手段，膿毒癥早期血小板內核心分子表達量和功能變化尚未完全闡明；近年學者們開始借助單細胞高通量測序和生物信息學技術分析疾病狀態下血小板的病理變化［11-12］。

本課題首先建立膿毒癥單病種數據庫進行前瞻性病例對照研究，比較不同預后組患者疾病早期的臨床特征，篩選死亡相關的獨立危險因素。然后，采集健康志愿者和膿毒癥患者外周靜脈血，分選富含白細胞和血小板的樣本做單細胞高通量測序；然后，借助生物信息學技術，分析膿毒癥早期血小板內分子表達量和核心功能的變化，為膿毒癥精準治療提供科學依據，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 倫理聲明 本課題臨床實驗遵守《赫爾辛基宣言》，研究獲得空軍軍醫大學第一附屬醫院倫理委員會批準（編號：KY20212172 和NCT05229328）；單細胞測序組受試者均自愿參與本研究并簽署知情同意書。質控員負責數據管理，全程督導并協調落實受試者權益。為控制誤差偏倚，對患者采取同質化治療，組織學習最新膿毒癥診斷標準和治療規范［13-14］。

1.2 膿毒癥納入和排除標準 國內外指南尚未明確定義“膿毒癥早期”，一般指炎癥反應明顯但尚未出現多臟器功能衰竭的早期階段，常為發病后數小時至數天。本研究納入標準：（1）膿毒癥 =感染+ 序貫器官衰竭評分（SOFA） ≥ 2；（2）出現感染癥狀 ＜ 72 h，診斷時間 ＜ 24 h；（3）18 ～ 80 歲，簽署知情同意書；（4）無嚴重慢性疾病史（硅沉著病、心功能不全Ⅲ-Ⅳ級、腫瘤、血液疾病或免疫疾病等）。排除標準：（1）妊娠期、哺乳期或新發現的腫瘤患者；（2）3 個月內服用免疫和凝血功能類藥物；（3）各種原因導致治療中斷或中途退出者；（4）隨訪脫失（90 d）或資料不全。

1.3 患者臨床特征數據采集 臨床科研專職人員負責患者入組，收集空軍軍醫大學第一附屬醫院急診科收治的膿毒癥患者臨床數據，包括一般信息、入室生理指標、實驗室檢驗指標、疾病評分（SOFA、NEWS）及90 d預后。2021年1月至2023年6 月期間共收治605 例，納入257 例，排除30 例，失訪3 例，最終224 例患者入組。男145 例（64.7%），女79 例（35.3%）；感染部位以呼吸系統為主151 例（67.4%），其次為消化系統44 例（19.6 %），泌尿生殖系統27 例（12.1 %），神經系統和皮膚軟組織感染較少，各1 例。139 例（62.1%）患者病情危重入住監護室；發病90 d 隨訪，158 例（70.5%）存活，66 例（29.5%）死亡，不同預后組患者的臨床特征比較見表1。

表1 不同預后組膿毒癥患者疾病早期臨床特征的比較Tab.1 Comparison of clinical characteristics of sepsis patients in the early stages between different prognostic groups M（P25，P75）

1.4 外周靜脈血采集和處理 自肘靜脈采集健康者和膿毒癥患者血樣8 mL，顛倒混勻后轉移至淋巴細胞分離管中（DAKEWE 生物技術公司，深圳，中國）。室溫下離心15 min（400g），分為3 層：血漿位于上層；白細胞和血小板位于中層；紅細胞和分離液在下層。

1.5 單細胞RNA 測序 外周血細胞樣本送至廣州基迪奧生物技術公司行單細胞測序。簡要步驟：（1）采用10×基因組學測序儀（Illumina Novaseq 6000）進行測序，構建基因文庫。（2）細胞注釋分群，篩選疾病組與健康組血小板差異基因（倍數變化≥ 2 倍且P＜ 0.05）。（3）借助GO 術語和KEGG 信號通路數據庫進行功能富集，分析疾病早期血小板功能改變。

1.6 統計學方法 使用SPSS 28.0軟件進行統計分析，借助GraphPad Prism 9.0繪圖。首先采用Kolmogorov-Smirnov對連續性變量進行正態性檢驗，非正態數據以M（P25，P75）表示，Mann WhitnyU檢驗比較組間差異；正態數據以（均數±標準差）表示，組間比較采用t檢驗。多因素logistic回歸分析膿毒癥患者死亡的危險因素，ROC 工作曲線檢測預測效能。P＜ 0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同預后組患者疾病早期臨床特征及死亡高危因素分析 死亡組患者早期心率、呼吸頻率、NEWS 評分、SOFA 評分、血漿總膽紅素、肌酐和乳酸較存活組顯著增高；平均動脈壓和血小板計數則降低。將上述9 個指標進行logistic 回歸（向后法）分析死亡的危險因素，結果血乳酸、SOFA、平均動脈壓和血小板計數進入回歸方程，統計數據見表2。采用ROC 曲線評估預測效能，血乳酸、SOFA、血小板計數和平均動脈壓的ROC 曲線下面積（AUC）分別為0.85、0.73、0.71 和0.69；血小板計數+血乳酸+SOFA三因素聯合預測時AUC = 0.89。

表2 Logistic 回歸納入臨床指標的統計學參數及其ROC 曲線指標Tab.2 Statistical parameters and ROC curve indicators for clinical indicatorsthat included in logistic regression

2.2 單細胞測序組受試者的臨床特征 為系統分析膿毒癥時血小板功能的變化，課題組收集3 例健康志愿者和3 例膿毒癥早期患者的外周血細胞樣本進行單細胞測序。3 例膿毒癥患者感染部位及病原微生物培養結果：病例1 系雙下肺感染，痰培養見銅綠假單胞菌生長；病例2 為胰腺炎合并左下肺感染，痰培養和血培養均回報大腸埃希菌；病例3 系急性腎盂腎炎，尿液培養見大腸埃希菌生長。獲得細菌培養和藥敏實驗結果后，主管醫生從早期經驗性治療轉為敏感抗生素的精準治療，90 d 隨訪均存活。

2.3 細胞注釋分群及其膿毒癥時差異基因數量借助標志性分子對細胞注釋分為6 群，單核細胞-CD14/CD16/CD68/CD163/CSF1R/S100A12；樹突狀細胞-CD11b/CD11c/CD15/CD83/CLEC4C/CD83/LYZ；中性粒細胞-S100A8/S100A9；B 細胞-CD19/CD79a/CD79b/BLNK/MS4A1；T 細胞和自然殺傷細胞（NK細胞）-CD3d/CD3e/CD8a/CD27/CD28/NKG7/GZMB；血小板-CD41/CD42a/CD61（圖1）。重點關注參與固有免疫反應的炎性細胞（單核細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞）以及與凝血功能密切相關的血小板，發現膿毒癥早期固有免疫細胞數量占比較健康組顯著升高（2.15∶1）；與之相反，血小板數量占比則顯著下降（0.31∶1）。

圖1 細胞注釋分群及膿毒癥早期各細胞亞群差異基因數量Fig.1 Annotation and grouping of cells using biomarkers and the number of differentially expressed genes in various cell subpopulations during early sepsis

比較各亞群細胞膿毒癥早期較健康狀態時顯著差異的基因數量，單核細胞差異基因最多1 969 種，其次為血小板（1 872 種）和中性粒細胞（1 798 種），再次為T 細胞NK 細胞和B 細胞，樹突狀細胞差異基因數量最少為536種（圖1）。

2.4 血小板標志分子的特異性分析 本研究將ITGA2B（CD41）、GP9（CD42a）和ITGB3（CD61）作為血小板的標志性分子，聯合診斷能較好地注釋血小板使其獨立成群。上述3 種分子在血小板特異性豐度表達，且膿毒癥時血小板內表達量進一步顯著上調；與之不同，無論在健康組還是膿毒癥組受試者，CD41/CD42a/CD61 在外周血各類型免疫細胞中的表達量均極低，圖2。以上提示CD41/CD42a/CD61 可作為血小板的特異性標志分子。

圖2 血小板標志分子（CD41/CD42a/CD61）特異性的分析Fig.2 Analysis of the specificity of platelet marker molecules（CD41/CD42a/CD61）

2.5 膿毒癥時血小板內表達量顯著差異的基因膿毒癥時，血小板內771 種基因顯著上調，按照差異顯著性依次為HPSE、TIMP1、CLEC1B、PF4、HBB、S100A8、PPBP、ZYX、SELP 和FCGR2A；1101種基因顯著下調，按照差異顯著性依次為EEF1A1、RPS3、TXNIP、RPS6、CD3E、H3-3B、PTPRC、IL32、GZMA 和IFITM1（圖3）。其中ZYX、SELP和PTPRC與細胞黏附功能密切相關；PF4、PPBP 和IL32 是細胞因子互作以及趨化作用相關信號通路的核心分子；CLEC1B、S100A8 和IFITM1 參與免疫功能調節；FCGR2A 和RPS3 與致病性大腸桿菌感染相關。

圖3 膿毒癥時血小板內表達量顯著上調和下調的基因Fig.3 Genes significantly up-regulated and down-regulated in platelets during sepsis

2.6 血小板差異基因的功能富集分析 課題組借助生物信息學分析技術，進一步探索了膿毒癥發病早期血小板的功能變化情況。差異基因富集的TOP-20 信號通路多與人類疾病相關（8 條），其次為器官系統變化（7 條），4 條為基因信號轉導相關通路，另外包括1 條涉及機體代謝功能的信號通路（圖4）。

圖4 膿毒癥時血小板差異基因富集的信號通路（TOP-10）Fig.4 Signal pathways enriched with differentially expressed genes in platelets during sepsis （TOP-10）

GO 功能分析提示膿毒癥早期血小板差異基因富集于多種凝血相關功能（血小板生成、活化、脫顆粒、聚集以及凝血過程），并且還與機體免疫功能密切相關（固有免疫反應、白細胞黏附、趨化作用、淋巴細胞增殖和細菌感染應答），見圖5。KEGG 功能富集進一步提示膿毒癥早期血小板參與細胞氧化磷酸化、白細胞趨化、抗原提呈和腸道感染相關信號通路，此外血小板還參與鐵死亡以及焦亡相關的NOD 樣受體信號通路（圖5）。以上功能分析提示膿毒癥早期血小板介入凝血級聯反應、免疫應答以及炎性細胞病理性死亡。

圖5 膿毒癥早期血小板差異基因GO 和KEGG 功能富集分析（列出通路均P ＜ 0.05）Fig.5 Functional enrichment analysis of GO and KEGG for differentially expressed genes in platelets during early sepsis（P ＜ 0.05 for all pathways listed）

3 討論

膿毒癥發病率高病情進展快，本組224 例患者中62.1%需要入住監護室進行治療，90 d 病死率為29.5%，稍低于國內多中心調查數據（35.5%）［4］。提示膿毒癥目前仍是急診科和重癥醫學科醫生面臨的重大挑戰，需要認真開展真實世界臨床研究，尋找膿毒癥疾病早期與死亡相關的高危因素，預警危重病例并及時給予加強監護治療，阻斷疾病進展為多臟器功能衰竭，從而有效改善患者預后。

本研究不同預后組患者發病早期的9 項指標差異有統計學意義，且高乳酸、高SOFA、低平均動脈壓和低血小板計數是預后不良的獨立危險因素；血乳酸的預測效能較好，乳酸+SOFA+血小板計數三者聯合診斷時效能更高。血乳酸增高是因微循環灌注不足，細胞缺血缺氧所致，血乳酸被推薦為評估膿毒癥病情嚴重程度和指導臨床治療的核心指標［15-16］。多項研究證實高乳酸血癥與患者高病死率密切相關［17-18］，這也與本研究結果一致。

本課題借助單細胞測序和生信分析技術，鑒定出CD41、CD42a 和CD61 特異性豐度表達于血小板，且膿毒癥時含量進一步顯著上調，可以作為血小板的標志性分子。CD41 又名ITGA2B，中文名稱整合素α2b，通過調節血小板聚集在血液凝固過程中起著至關重要的作用，可用做鑒別血小板來源外泌體［19］。CD42a 又名GP9，中文名稱血小板膜糖蛋白IX，該基因缺陷時血小板形態異常增大且功能障礙，臨床患者有出血傾向。Martins 將CD42a 作為標志分子，借助共聚焦激光掃描顯微鏡觀察癌細胞攝取血小板的過程［20］。CD61 又名ITGB3，中文名稱整合素亞單位β3，參與細胞黏附以及細胞表面信號傳導，該基因缺陷將導致血小板無力癥［21］。此外，CD41、CD42a 和CD61 抗體常被用作流式細胞計數實驗來探索疾病狀態下血小板功能變化［22-23］。

本研究發現膿毒癥早期血小板占比較健康組顯著降低（0.31∶1）；血小板內差異基因數量與主要固有免疫細胞內差異基因數量相當（單核細胞和中性粒細胞）。血小板內顯著上調和顯著下調的基因包括介導細胞黏附、趨化作用和免疫應答等重要功能的核心分子。進一步探索差異基因富集的TOP-20 信號通路，與人類疾病、器官功能變化和細胞信號轉導相關；GO 和KEGG 功能分析提示膿毒癥早期血小板密切參與凝血級聯、免疫應答以及免疫細胞死亡等重要的病理變化，以上病理過程均消耗外周血小板導致其數量顯著減少。

膿毒癥炎癥應激會導致免疫細胞死亡，引發免疫抑制或二次感染造成不良預后。近年，膿毒癥時免疫細胞內多種死亡相關分子上調和死亡信號通路激活引起學者對免疫細胞程序性死亡的關注，包括焦亡、鐵死亡、自噬和胞外陷阱相關細胞死亡（METosis/NETosis）［24-25］。膿毒癥早期巨噬細胞和中性粒細胞在血小板介導下變得扁平，細胞膜破裂胞內染色質、組蛋白和細胞質成分被擠壓成網狀結構，即胞外陷阱網（METs/NETs），能夠捕獲并殺死病原菌；然而，BOE 和YIPP 研究指出胞外陷阱網殺菌時細胞裂解成游離DNA 和組蛋白而死亡，即METosis/NETosis，釋放的DNA 和組蛋白是DAMPs 的主要來源［26-27］，激活凝血引發DIC 和MODS［28］。多項研究提示血小板介導的METosis/NETosis 與免疫細胞、上皮細胞和內皮細胞損傷密切相關［29］，在膿毒癥的發生和進展中發揮重要作用。

總之，本研究通過臨床前瞻性病例對照研究發現膿毒癥早期血小板計數減少是不良預后的獨立危險因素；借助先進的單細胞高通量測序和生物信息學分析技術，鑒定出CD41/CD42a/CD61 是血小板的標志分子；并發現疾病早期血小板不僅介導細胞黏附和凝血級聯，還參與免疫細胞趨化、炎性應答和細胞病理性死亡等功能變化。不足之處：臨床研究為單中心，僅是觀察性研究；單細胞測序納入病例數較少，未開展基礎實驗對結果進行驗證。因此，有必要開展多中心隨機對照性研究進一步證實疾病早期血小板計數與膿毒癥預后的關系；需要更深入的基礎研究繼續探索膿毒癥早期血小板核心功能變化并開發相關靶向治療策略。

【Author contributions】WANG Xianqi performed the experiments and wrote the article. ZHANG Bin， ZHANG Qi， DAI Zheng， ZHANG Jinxin， and LIANG Xiaoli performed the experiments. LI Lin and WU Lin revised the article. LIU Shanshou designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.