壽司中菌落總數(shù)檢測的不確定度評定

謝清華 吳小鳳 陳韻妍

隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展，人民的生活水平日益提高，各類食品的質(zhì)量和品種也不斷煥然更新。然而，近年來食品安全問題屢見不鮮，尤其是微生物安全問題嚴重令人擔憂，由食品微生物引起的安全問題更是嚴重且迅速，部分病原微生物引發(fā)的疾病甚至具有傳染性。面對微生物帶來的巨大隱患，國家相關部門將微生物檢測列為食品檢測的強制指標。菌落總數(shù)作為食品日常檢測中最為普遍的衛(wèi)生檢驗指標之一，能夠反映食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求，準確地展現(xiàn)細菌對食品的污染程度。在食品原料生產(chǎn)、成品加工、包裝與運輸?shù)倪^程中，菌落總數(shù)的檢測至關重要[1-5]。為了幫助檢驗人員全面了解和有效分析樣品特征，準確理解檢驗水平，為實驗室提供可靠的檢測結(jié)果，體現(xiàn)日常實驗工作的精確性和科學性，必須引入測量不確定度。測量不確定度是評估實驗室檢測水平的重要指標，衡量被測量值的不確定性大小，也是評價測量結(jié)果質(zhì)量的關鍵參數(shù)。由于其能夠反映測量結(jié)果的精確性、可靠性和準確性，測量不確定度在檢驗檢測行業(yè)中得到廣泛應用[6-7]。本研究以20份市售壽司樣品為對象，根據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[8]和《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）[9]的規(guī)定，進行了食品中菌落總數(shù)的檢測。文章中體現(xiàn)了《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2022）[10]執(zhí)行標準。在此過程中，詳細考察了測量不確定度的來源，然后對其進行詳細評估，遵循標準的要求，最終得出了一組可信賴的測量不確定度置信區(qū)間。這一過程有助于確保食品樣品中菌落總數(shù)的測定結(jié)果的準確性和可靠性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2023年4—8月20份市售壽司進行分析。平板計數(shù)瓊脂，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；氯化鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司。Scout系列電子天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；GR85DR高壓蒸汽滅菌鍋，致微（廈門）儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海玉博科技有限公司；XH-B型旋渦混合器，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司。

1.2 方法

依據(jù)《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2022）[10]，稱取25 g樣品置于盛有225 mL生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，充分混合均勻，制成1∶10的樣品勻液；用1 mL無菌吸管于1∶10樣品勻液吸取1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL稀釋液的無菌生理鹽水試管中，振搖試管，制成1∶100的樣品勻液；按上述操作，制備10倍系列稀釋樣品勻液，選擇2～3個適宜稀釋度的樣品勻液，吸取1 mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做2個平皿；同時，分別吸取1 mL空白稀釋液加入2個無菌平皿內(nèi)作空白對照；配制平板計數(shù)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，及時將15～20 mL冷卻至46 ℃傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻；平皿水平放置，待瓊脂凝固之后，將平板翻轉(zhuǎn)，置于（36±1）℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)（48±2）h；肉眼觀察并認真記錄平皿中的菌落數(shù)，按照標準的計數(shù)規(guī)則進行計算，選取菌落總數(shù)在30～300的平皿，將該稀釋梯度的平皿的菌落總數(shù)數(shù)值乘以對應的稀釋倍數(shù)，即可得到該待測樣品的菌落總數(shù)。

式中N為樣品菌落總數(shù)的和；C為平板菌落總數(shù)之和；n1為低稀釋倍數(shù)（第一稀釋度）平板個數(shù)；n2為高稀釋倍數(shù)（第二稀釋度）平板個數(shù)；d為稀釋因子（第一稀釋度）。

1.3 觀察指標

觀察各稀釋倍數(shù)平板的菌落個數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學處理

運用WPS 2019軟件建立數(shù)據(jù)庫，進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

2.1 測量不確定度的來源

在日常測試中，許多不確定因素會影響細胞總數(shù)。原因可以從人員、環(huán)境、儀器設備、材料、測量方法等多個角度進行分析。該實驗的不確定性來源之一是人為因素。盡管由同一實驗人員操作，但在相同稀釋度下采集2個重復樣品也會引入不確定性，該不確定性被定義為A類標準不確定性。另一個重要因素是儀器的設備：用量筒測量、用天平和刻度移液管測量是此類不確定度的主要因素。本試驗使用相同的天平、量筒和刻度移液管，因此固定了類型影響值并定義了B型標準不確定度。本測試是由同一個人在同一環(huán)境、采用相同的測試方法進行的，因此可以忽略環(huán)境、測量方法和材料的影響。

2.2 A類標準不確定度的評定

對于20個樣品進行菌落總數(shù)測定，每個稀釋度的菌落數(shù)需做2個平板。由于微生物實驗數(shù)據(jù)相差很大，不能直接進行統(tǒng)計，可以對檢測結(jié)果取對數(shù)后，計算出樣本結(jié)果對數(shù)值的平均值和殘差平方和，其計算結(jié)果見表1。

表1 20份壽司中菌落總數(shù)計數(shù)結(jié)果及計算

根據(jù)貝塞爾公式，可以計算得出實驗結(jié)果對數(shù)值標準偏差的合并樣本標準差Sp：

在正常檢測當中，因樣品要進行2次平行實驗，故由測量重復性引入的A類標準不確定度UA＝0.044 5。

2.3 B類標準不確定度的評定

2.3.1 由電子天平引入的不確定度

(3)規(guī)劃水平年(2020年、2030年)灌溉保證率50%相比75%，水資源承載能力評分較高，說明可以采用降低保證率灌溉更多耕地的方法以達到總產(chǎn)值的增加，提高山塘水資源的承載能力。

稱量樣品，25.0 g至含有225 mL無菌生理鹽水中，該過程使用的電子天平量程為0.2～620 g，根據(jù)天平的檢定證書，電子天平的允許誤差為±0.1 g，按均勻分布計算，k＝，故由電子天平引入的標準不確定度為：

則相對標準不確定度為：Ucrel（m）＝0.002 3。

2.3.2 由量筒引入的不確定度

在樣液制備過程中，需要用250 mL量出式量筒量取225 mL生理鹽水，根據(jù)《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）規(guī)定，250 mL量出式量筒的允許誤差為±2.0 mL，按均勻分布計算，k＝，故由量筒引入的標準不確定度為：

則相對標準不確定度為：Ucrel（v1）＝0.005 1。

2.3.3 由分度吸量管引入的不確定度

在制備10倍系列稀釋樣品勻液的過程中，使用了A級1 mL分度吸量管吸取樣品勻液、A級10 mL分度吸量管吸取9 mL生理鹽水，按照《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）的規(guī)定，A級的1 mL分度吸量管和A級的10 mL分度吸量管，允許的誤差分別為±0.01 mL和±0.025 mL，按均勻分布計算，k＝，故由A級1 mL分度吸量管引入的標準不確定度為：

相對標準不確定度為：Ucrel（v2）＝0.005 7

故由A級10 mL分度吸量管引入的標準不確定度為：

則相對標準不確定度為：Ucrel（v3）＝0.001 6。

故B類相對標準不確定度UB＝0.014 7。

2.4 合成標準不確定度

合成標準不確定度UC是指由在一個測量模型中各輸入量的標準不確定度獲得的輸出量的標準測量不確定度。

故合成標準不確定度為：UC＝0.046 9。

2.5 擴展不確定度

擴展不確定度是預期結(jié)果的區(qū)間，具有一定的置信度（置信區(qū)間）。取95%的置信水平，v＝20，查t分布表得k＝2.086。

故擴展不確定度為：U＝0.098 7。

2.6 計算結(jié)果

根據(jù)相關規(guī)定，檢測的結(jié)果在對數(shù)值log報告中表示為：log±0.097 8。舉例來說，對于第2號樣品，將2次檢測結(jié)果取對數(shù)后求平均值，得到平均值為3.360 1，這個結(jié)果的取值范圍在3.262 3～3.457 9。將這個對數(shù)結(jié)果取反對數(shù)后，得到測量結(jié)果的取值范圍為1 800～2 800。其他樣品的菌落總數(shù)計算結(jié)果也可以按照類似方式進行推導。

3 討論

本試驗是對市場上銷售的20種不同種類的壽司進行檢測，樣本中菌落總數(shù)測定結(jié)果彼此差異較大，已經(jīng)不適宜使用標準差來直接評價檢測結(jié)果的不確定度，故應在取對數(shù)后計算結(jié)果，用這種方法來表示結(jié)果的不確定度。張云龍等[11]在評定燒烤制品菌落總數(shù)檢驗的不確定度時也用這種方法評定。

測量不確定度評定的結(jié)果表明，在測量過程中，由于測量重復性引入的A類標準不確定度對于實驗結(jié)果的測量不確定度的影響較大，相比之下，來自天平稱量、量筒、分度吸量管等引入的B類標準不確定度對不確定度的影響較小。識別測量不確定度的來源至關重要，因為測量不確定度的產(chǎn)生涉及多個因素，正確分析和辨認這些來源在確定測量不確定度方面具有重要作用，也為對測量不確定度評估奠定了基礎。測量不確定度評定是確保食品菌落總數(shù)測試結(jié)果準確性的重要方法。食品樣品本身的差異性、實驗操作技術的不確定性以及統(tǒng)計分析等因素都會對菌落總數(shù)檢驗結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，評定不確定度能夠揭示測量結(jié)果的波動程度，并提供一個范圍來描述測量結(jié)果的可信度[12]。食品樣品的采集和處理過程對菌落總數(shù)的不確定度評定具有重要影響。在采集樣品時，應確保樣品的代表性和一致性，避免外界污染和樣品自身變質(zhì)。處理過程需要按照標準方法進行，嚴格控制操作流程和參數(shù)，確保實驗的可重復性和準確性。實驗室儀器的精密度也是評定菌落總數(shù)不確定度的關鍵因素之一。儀器需要定期進行校準和驗證，以確保結(jié)果的準確性和可靠性。同時，儀器的使用者都需要經(jīng)過專業(yè)培訓，熟悉操作流程和儀器特點，提高實驗的可重復性[13]。統(tǒng)計學方法在評定菌落總數(shù)不確定度中起著重要作用，通過對樣本數(shù)量、變異性和可信度等進行統(tǒng)計分析，可以得出菌落總數(shù)測試結(jié)果的不確定度范圍。不確定度的大小與樣本數(shù)量、測量誤差和置信水平等因素密切相關[14-16]。

綜上所述，實驗室在進行微生物培養(yǎng)時需要創(chuàng)建一個穩(wěn)定的環(huán)境，這種穩(wěn)定的環(huán)境能夠有效地保障檢驗結(jié)果的準確性。食品菌落總數(shù)的不確定度評定是確保食品安全質(zhì)量的重要手段。通過評定不確定度，可以提高食品菌落總數(shù)測試結(jié)果的可靠性和準確性，為食品安全管理提供科學依據(jù)，保障公眾健康和食品安全。