向海一號桑組培快繁技術優化

【摘要】：為提高育苗效率，以向海一號桑莖段為外植體，開展了腋芽誘導培養、增殖培養、生根培養的研究，優化了其組培快繁體系。結果表明：腋芽誘導培養最適培養基為MS＋6-BA3.0mg/L＋IAA0.1mg/L，誘導率達78.3%；增殖培養的最適培養基為4/5MS（大量）+6-BA0.1mg/L+NAA0.15mg/L，30天左右平均增殖倍數達5.12；生根培養的最適培養基為1/2MS（大量）＋1/4MS（鐵鹽）＋IBA1.0mg/L，生根率達82.5%左右，8天開始生根，28天后即可移栽煉苗。達到了優化向海一號桑組培快繁技術的目的。

【關鍵詞】向海一號桑；組織培養；快繁

Optimization of tissue culture and rapid propagation of Xianghai No.1 Mulberry

Gu Meiying， Yang Aiguo， Li Zhenzhou， Su Lin^*

（Baicheng City Forestry Research Institute， Baicheng， Jili`n， 1370001）

Abstract："The stem segment of Mulberry Xianghai No.1 was used as explants to optimize its tissue culture and rapid propagation system through axillary bud induction culture， proliferation culture and rooting culture. The results showed that the optimal medium for axillary bud induction culture was MS+6-BA3.0mg/L+ AA0.1mg/L， and the induction rate was 78.3%；The optimal medium for proliferation culture was 4/5MS （large amount） +6-BA0.1mg/L+ NAA 0.15mg/L， and the average multiplication ratio was 5.12 in 30 days；The optimal medium for rooting culture was 1/2MS （large amount） +1/4 ms （ferritic salt） +IBA1.0mg/L， and the rooting rate reached about 82.5%. Rooting began 8 days later， and the seedlings could be transplanted and cultivated 28 days later. It has achieved the goal of optimizing the tissue culture and rapid propagation technology of Xianghai No.1 mulberry.

Key words："Xianghai No.1 mulberry;"tissue culture; rapid propagation

桑，屬桑科（Moraceae）桑屬（Morus），落葉喬木。白城市林科院于1998年開展了向海一號桑的選育工作，并于2003年通過吉林省林木品種審定委員會審定。向海一號桑葉大、質優、生長旺盛，具有抗寒（耐極端溫度-40℃）、耐旱（耐80 mm年降水量）等特點，其產葉量、蛋白質等有效含量及養蠶成績均相當于秋雨桑，適于干寒地區栽培^[1]。基于向海一號桑的優質性狀，推廣前景比較好，對該品種進行快繁迫切重要。組培快繁技術不受季節限制，繁殖速度快，且可在短期內獲得大量的脫毒優質苗^[2]。為大力推廣向海一號桑，本研究利用其莖段為外植體進行組培快繁技術優化，以期為將來工廠化育苗提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 建立無菌體系

2021年12月，于白城市林業科學研究院采取向海一號桑硬枝枝條，在實驗室進行水培催芽，30天后剪下萌發嫩枝作為外植體。將外植體用無菌水反復沖洗干凈，然后在洗衣粉水中浸泡15min，再用無菌水沖洗干凈，之后轉移到在超凈工作臺上，在適當大小的消毒瓶中，用75%的酒精進行震動搖晃消毒（30s、45s、60s、75s、90s），后再用無菌水沖洗6次，每次1min，沖洗掉外植體表面酒精。最后取出外植體，用無菌濾紙吸干其表面的水分，切除外植體基部被酒精侵蝕的部分，接種到腋芽誘導基本培養^[3]。10天后觀察記錄接種外植體污染、死亡及褐化情況。

1.2 腋芽誘導培養

通過查閱文獻，并進行了大量的預試驗，向海一號桑莖段腋芽誘導培養所需的激素確定為6-BA（1.0、2.0、3.0mg/L）和IAA（0.1、0.2、0.3mg/L），以MS為基本培養基，添加蔗糖30g/L，瓊脂粉6.0 g/L，pH5.8-6.0。一葉一段或兩葉一段，每處理15個外植體，重復3次。30天后統計腋芽萌發情況，篩選出適合向海一號桑的腋芽誘導培養基。

1.3 增殖培養

向海一號桑莖段增殖誘導激素選擇6-BA，經大量預試驗得知，結合6-BA并降低MS中大量元素可使其增殖倍數增加。采用3因素3水平正交試驗設計，以MS（大量元素含量1/4、1/2、4/5，其他不變）為基本培養基，并添加不同濃度的6-BA（0.1、0.5、1.0mg/L）、NAA（0.05、0.10、0.15mg/L），添加蔗糖30g/L，瓊脂粉6.0 g/L，pH5.8-6.0。每處理15個外植體，重復3次，30天后統計增殖情況，篩選出適合向海一號桑增殖誘導的培養基。

1.4 生根培養

待組培苗長度長到5cm左右，即可進行生根培養。切掉組培苗部分基部，接種到生根培養基中進行生根培養^[3]。經預試驗，生根培養基配方以MS中大量元素和鐵鹽變化為主來設計，激素IBA1.0mg/L，瓊脂粉6.0 g/L，添加蔗糖15g/L，pH5.8-6.0，每處理15個外植體，重復3次，30天后統計生根率，同時結合幼苗生長狀況，從而篩選出向海一號桑最適生根培養基。

1.5 培養環境

組培苗最適生長環境為溫度為25±2℃，空氣相對濕度50%-60%，光照時間16h/d，光強為1500-2000Lx，試驗所用藥品均為分析純^[3]。

1.6 數據分析

本試驗數據使用Excel進行分析。

污染率=外植體污染數/接種外植體總數×100%；

死亡率=外植體死亡數/接種外植體總數×100%；

誘導率=腋芽萌發數/接種株數×100%；

增殖倍數=增殖株數/接種株數；

生根率=生根株數/接種株數×100%。

2 結果與分析

2.1 消毒時間對無菌體系建立的影響

本試驗消毒時間設為30s、45s、60s、75s、90s，消毒結果見表1。因外植體來自室內硬枝水培萌發，所以污染程度相對較低，只選用了洗衣粉水浸泡和75%酒精消毒。由表1可知，處理1和2的消毒時間較短，污染率則較高，可達53%以上，但沒有出現死亡現象，褐化程度較輕；處理3、4和5的消毒時間依次增加，污染率依次降低在10%-13%左右，但死亡率依次增高，最高可達64.7%，且褐化程度加重。綜合污染率、死亡率和褐化情況，處理3為向海一號桑無菌體系建立的最佳消毒方法，即洗衣粉浸泡15min+75%酒精60s，污染率最低、死亡率較低且褐化程度較輕。

2.2 不同濃度激素對腋芽誘導培養的影響

由表2可以看出，在腋芽誘導培養過程中，6-BA的濃度在2.0-3.0 mg/L的階段，誘導率較高，在63.8%-78.3%，而6-BA的濃度在1.0 mg/L時，誘導率不到50%；觀察IAA濃度的變化會發現隨著IAA濃度的升高，誘導率則下降，這與6-BA的交互作用有一定的關系，其中，在6-BA3.0mg/L、IAA0.1mg/L時，誘導率最大達78.3%。結合誘導的腋芽實際生長狀況，在6-BA的濃度較低時，產生的愈傷組織較少，但新芽的長勢較弱，葉片會停留在芽孢伸展較慢，如圖1-1；隨著6-BA的濃度增加，伴以適合濃度的IAA，腋芽長勢較好，葉片翠綠，如圖1-2；當腋芽本身是花芽時，會先在瓶內開花，繼代時可直接切掉花的部分，如圖1-3。綜上，最適宜向海一號桑腋芽誘導的培養基為處理7：MS＋6-BA3.0mg/L＋IAA0.1mg/L。

2.3 不同濃度激素對增殖培養的影響

將腋芽誘導出的幼苗接種到增殖培養基中，培養7-10天后，幼苗開始有變化產生，主要表現為切口處略膨大，在腋芽處有新芽萌動，培養30天后進行統計，結果見表3。9個不同的培養基均能對向海一號桑幼苗進行增殖誘導，其中6-BA對向海一號桑增殖效果的影響最為顯著，6-BA為0.1mg/L時，增殖生長效果最好，增殖系數最高達5.12，平均為4.73，較為0.5mg/L時的平均增殖系數高出10.8％，較為1.5mg/L時的平均增殖系數高出27.5％。在培養過程中，向海一號桑的葉片會表現出輕度的向下卷曲，容易將整株幼苗頂出培養基，如圖2-2，所以在接種時，需要整理最下面一輪葉片，留有足夠的空間。分析各因素極差的大小，可以得出對增殖系數大小產生效應的主次順序依次為6-BA、NAA和MS大量元素^[4]。極差分析表明，最適增殖培養基為4/5MS（大量）+6-BA0.1mg/L+NAA0.15mg/L。

2.4不同MS元素濃度對生根培養的影響

向海一號桑的生根誘導較為容易，主要誘導激素為IBA，濃度在1.0mg/L。從表4可知，1/2的大量元素可以較快的誘導根的形成，生根率達80%以上，且根部長勢較好、須根多，如圖3-2，生長40天后如圖3-3和3-4；1/4的大量元素亦可以誘導成根，生根率可達74%-78%，生根率也很高，但是根部生長效果不佳，根細軟略透明，且須根較少，如圖3-1。所以綜合試驗，適合向海一號桑生根的培養基為：1/2MS大量元素＋1/4MS鐵鹽＋IBA1.0mg/L。

2.5 煉苗移栽

待組培苗生根28天左右即可進行煉苗，時間過長根部也會過長，移栽時粘連培養基過多，容易爛根；而且幼苗長得過高，移栽時不易直立。在煉苗過程中，需注意控制澆水次數和水量，避免過澇。中午陽光強時，需注意控溫，避免燒死幼苗^[3]。煉苗10天后可逐步撤去薄膜，正常自然光照。煉苗基質需注意其通透性，以泥炭土：蛭石：珍珠巖為1：1：1為最適，移栽10-15d長勢明顯，幼苗生長健壯，見圖4，統計成活率為86%。

3 結論與討論

在向海一號桑無菌系建立過程中，選擇外植體的時間比較關鍵。通常選擇春季剛萌發的嫩枝最好，春季嫩枝生命力旺盛，且污染程度低，不需要用Hgcl₂等進行消毒。本試驗因季節原因，采用了室內硬枝水培獲取外植體，利用洗衣粉水浸泡和75%乙醇消毒，可達到降低污染率的目的。試驗結果表明，乙醇消毒時間是關鍵，75%乙醇消毒60s可達到最佳消毒效果，污染率為13.5%，死亡率為3.7%。時間過短則無法控制污染率，過長則會導致植株死亡率增加。另，在接種過程中，植株會產生褐化現象，這是植物組培的常見現象，這與培養基成分、外植體老化程度、消毒情況等多種因素有關^[5]，但在本試驗中，褐化程度隨著消毒時間的增加而增強，所以向海一號桑組培褐化現象可能與乙醇消毒時間有關。但褐化對向海一號桑幼苗的生長影響不大，會隨著繼代次數增加逐漸消失，一般第三代開始不再褐化。

在腋芽誘導階段，不同濃度的6-BA和IAA的配比，對誘導效果影響較大。生長素和細胞分裂素的配比使用，可以對植物的分化和發育起到調控作用^[6]，在本試驗中，較高濃度的6-BA和較低濃度的IAA組合，對向海一號桑的腋芽誘導較為明顯，6-BA3.0mg/L＋IAA0.1mg/L的腋芽誘導率可達78.3%，且分化芽苗長勢最好。

增殖培養中，增殖倍數大小產生效應的主次順序依次為6-BA、NAA和大量元素^[4]，增殖培養基的最佳組合為4/5MS（大量）+6-BA0.1mg/L+NAA0.15mg/L。細胞分裂素6-BA是植物組培中常用的增殖激素，試驗證明低濃度的6-BA有利于向海一號桑的增殖，這與王鳳軍^[7]的研究一致。本試驗中，適量降低MS中大量元素，可以增加增殖倍數，由此可知大量元素對于向海一號桑的增殖誘導及生長均有一定作用，這與胡瑩的研究有相似之處，即降低大量元素，不僅有利于促進山茶科植物莖段誘導及生長，對于減輕褐化也有一定效果^[8]。

向海一號桑生根比較容易，選用了生根常見的激素IBA，最佳生根培養基為1/2MS大量元素＋1/4MS鐵鹽＋IBA1.0mg/L，生根效果好，根粗壯、須根較多，生根率達82.5%。在移栽中，需掌握好移栽時間，組培苗生長過大、根生長過長都不利于移栽成活，培養28天左右，移栽最佳。

參考文獻

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