超高效液相色譜質譜法測定餅干中3 種大麻酚

張闖，趙孔祥，張敏，王利強*

（1.天津海關工業產品安全技術中心，天津 300457；2.天津海關動植物食品檢測中心，天津 300457）

大麻中主要成分有大麻酚、大麻二酚、四氫大麻酚3 種。其中大麻酚存在于大麻葉中，是一種脂溶性且不具有精神活性的大麻素，在藥用方面可以起到止咳、鎮靜、安眠等功效，同時大麻酚可以抑制四氫大麻酚引起的不良反應，加強四氫大麻酚的藥效，二者搭配使用常作為免疫疾病的主要治療手段[3-4]。大麻二酚是從大麻植物中提取的純天然成分，可以起到神經保護、抗炎、代謝與免疫調節等功效[5-6]。在我國大麻二酚屬于工業大麻級別，不允許用于食品和化妝品。四氫大麻酚是大麻中主要的精神活性物質，是大麻類毒品中對神經系統起作用的主要成分。我國已將四氫大麻酚列入第一類精神藥品管制目錄，藥理方面可起抗腫瘤、保護心血管和抗菌等作用[7]。因此，開展對餅干中大麻的分析檢測工作具有重要意義。

目前大麻酚類物質檢測主要有液相色譜[8-9]、氣相色譜[10]、氣相色譜-質譜[11]、液相色譜-質譜[12-14]、電化學[15]等技術，在食品安全檢測領域，質譜技術相較色譜技術存在明顯優勢[16-18]：靈敏度高，準確性強；抗干擾能力強，目標物質即便在色譜柱上分離效果不好，也可通過化合物的離子化狀態進行分析定量。氣相色譜質譜法適合易揮發、熱穩定、能氣化的化合物，同時需要衍生化處理，不適合大麻酚類物質檢測[19]，因此，本研究選擇液相色譜-質譜法進行大麻酚類物質的測定。

試驗運用QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）凈化結合超高效液相色譜-串聯質譜法，對餅干中大麻酚、大麻二酚和四氫大麻酚的測定進行研究。與之前大麻酚類物質研究相比，本研究首次采用大氣壓化學電子（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）源替代了以往使用較多的電噴霧離子（electrospray ionization，ESI）源，有效降低了基質效應對試驗的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Ultra 型超高效液相色譜-串聯質譜儀：美國賽默飛世爾科技有限公司；T25 高速分散機：德國IKA 公司；2-15 離心機：美國Sigma 公司。

乙腈、甲醇、乙醇、甲酸（色譜純）：上海安譜有限公司；試驗用水為Milli-Q 高純水。大麻酚（CAS 號：521-35-7）、大麻二酚（CAS 號：13956-29-1）、四氫大麻酚（CAS 號：192-08-3）：天津阿爾塔科技有限公司；氯化鈉、無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、檸檬酸鈉、醋酸鈉：國藥集團上海有限公司；N-丙基乙二胺、C18：天津博納艾杰爾科技有限公司；石墨化碳黑：上海安譜有限公司；其他所用試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

以乙腈配制質量濃度為10 μg/mL 的大麻酚、大麻二酚、四氫大麻酚混合標準溶液，于-18 ℃下儲存。以乙腈配制1 μg/mL 的混合標準工作液，配制濃度為2、5、10、20、50、100 ng/mL 的系列混合標準溶液，現配現用。

1.2.2 試劑配制

0.1%甲酸溶液：準確量取1 mL 甲酸于900 mL 水中，水定容至1 000 mL；乙腈-醋酸溶液（99+1）：量取10 mL 醋酸加入990 mL 乙腈中，混勻。

1.2.3 樣品前處理

1.2.3.1 樣品提取

稱取具有代表性的樣品5.00 g（精確至0.01 g）于50 mL 離心管中，準確加入乙腈-醋酸溶液（99+1）20 mL，振搖混合均勻，加入6 g 無水硫酸鎂、1.5 g 醋酸鈉，超聲提取10 min，8 000 r/min 離心5 min。

1.2.3.2 樣品凈化

吸取1 mL 上清液至內含150 mg 無水硫酸鎂、100 mg N-丙基乙二胺、50 mg C18 的2 mL 聚丙烯離心管中；渦旋混勻1 min，8 000 r/min 離心5 min，吸取上清液過微孔濾膜，用于測定。

1.2.4 色譜條件

色譜柱：Hypersil Gold C18 色譜柱（柱長50 mm，柱內徑2.1 mm，填料粒徑1.9 μm）；流動相A：0.1% 甲酸水溶液，流動相B：甲醇，流動相及洗脫條件見表1；柱溫：30 ℃；進樣量10 μL，流速0.3 mL/min。

表1 流動相及梯度洗脫條件Table 1 Mobile phase and gradient elution conditions

1.2.5 質譜條件

大氣壓化學電子源（APCI），正離子掃描模式；多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）；離子源溫度為300 ℃；放電電流：8.0 μA；霧化氣：氮氣，310 kPa；離子傳輸管溫度：300 ℃；碰撞氣：氬氣。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 流動相的選擇

本研究選擇0.1%甲酸水溶液作為水相溶劑，甲酸可以為陽離子的形成提供必需的質子來源，從而提高目標化合物的離子化效率。有機相對比了甲醇和乙腈兩種溶液，試驗發現在甲醇作為流動相的情況下，目標化合物的峰形、出峰時間以及響應強度更好。

2.1.2 色譜柱的選擇

本研究對比了C18、T3 兩種型號色譜柱。目標物在T3 柱下，目標物保留較弱，出峰快，樣品中共流出物容易干擾其測定。而在C18 柱下，目標物的峰形及質譜相應強度更好，同時保留時間合適。這是因為大麻酚、大麻二酚、四氫大麻酚都屬弱極性物質，C18 柱鍵合相上的極性基團修飾相較T3 柱更少，C18 柱相較T3 柱對弱極性分子保留能力更好。因此，選擇C18 柱作為本試驗分析用色譜柱。

2.2 質譜條件的優化

質譜條件的優化在電離源的選擇上，本研究對比使用ESI 和APCI 源時目標化合物的出峰情況發現，采用APCI 離子源，目標化合物回收率更好。這可能是因為大麻酚、大麻二酚、四氫大麻酚在溶液中離子化情況較差。ESI 是利用離子蒸發，液相離子化，而APCI 源則是依靠電暈針放電離子化，氣相離子化，同時相較ESI，APCI 源更適合弱極性化合物分析，檢出限也更低，更適合定量。質譜參數見表2，質譜圖見圖1。

圖1 3 種化合物多反應（MRM）色譜圖Fig.1 Chromatograms of three compounds under MRM monitoring

表2 3 種大麻酚多反應監測參數Table 2 MRM parameters for the three cannabinoids

2.3 前處理條件優化

QuEChERS 是近些年較為流行的食品檢測前處理方法。其原理類似于固相萃取，利用吸附劑自身特點，吸附基質中的雜質，達到凈化的作用。主要步驟包括：樣品制備、溶劑提取、鹽析劑除水，吸附劑除雜、上清液離心。相較于常用的液液萃取、微波萃取、固相萃取等傳統前處理方法，QuEChERS 操作更加便捷、操作時間更短、可應用的基質范圍更廣、有機溶劑用量更少[20]。

2.3.1 提取溶劑的選擇

分別選擇甲醇，乙醇、乙腈、乙腈醋酸溶液（99+1）、乙酸乙酯作為提取溶劑，在其他試驗條件不變的情況下，對標準添加餅干樣品進行提取，不同提取方式的目標化合物回收率見表3。

表3 不同溶劑對3 種大麻酚提取效率的影響Table 3 Effects of different solvents on the extraction efficiency of three cannabinoids

由表3 可知，提取用乙腈醋酸（99+1）溶液提取3 種化合物的回收率最好。因此選擇乙腈醋酸（99+1）溶液作為提取溶劑。

2.3.2 超聲時間的選擇

在其他試驗條件不變的情況下，不同超聲時間（4、8、10、15 min）下，陽性樣品目標化合物回收率變化情況見表4。

表4 不同超聲時間對3 種大麻酚提取效率的影響Table 4 Effects of different ultrasound time on the extraction efficiency of three cannabinoids

超聲波可以加速餅干在溶液中的溶解，提高反應速率和溶解度。由表4 可知，隨著超聲時間從4 min延長到8 min 再到10 min，目標化合物的回收率逐漸增大，而在10 min 和15 min 下，目標化合物的回收率基本沒有變化，因此選擇10 min 作為最終超聲時間。

2.3.3 萃取鹽包的選擇

餅干樣品經過乙腈提取后，需要加入萃取鹽包分離水相和有機相。選擇鹽包1（2 g Na2SO4+2 g NaCl）、鹽包2（4 g MgSO4+1 g NaCl）、醋酸體系鹽包3（6 g MgSO4+1.5 g CH3COONa）、檸檬酸體系鹽包（4 g MgSO4+1 g NaCl+1 g C6H5Na3O7+0.5 gC6H6Na2O7）4 種不同鹽包組合，通過比較目標化合物的回收率，確定合適的萃取鹽包。

其中鹽包1、鹽包2 屬于普通常規鹽包，鹽包3 屬于醋酸緩沖體系，是美國農業部AOAC2007 標準中QUCHERCES 鹽包，鹽包4 屬于檸檬酸緩沖體系，是歐盟EN15662 標準中QUCHERCES 鹽包。在其他試驗條件相同的情況下，加入這4 種鹽包，目標化合物的回收率，見圖2。

圖2 不同鹽包種類對3 種大麻酚提取效率的影響Fig.2 Effect of different types of salt packs on the extraction efficiency of three cannabinoids

由圖2 可知，加入醋酸體系鹽包3 后，3 種目標化合物回收率都較高，且使用鹽包3 提取后的溶液在質譜顯示的雜峰較少，因此本試驗選擇醋酸緩沖體系（6 g MgSO4+1.5 g CH3COONa）作為萃取鹽包。

2.3.4 吸附劑的選擇

樣品經初步凈化后需采用無水硫酸鎂、石墨化炭黑（graphitized carbon blacks，GCB）、N-丙基乙二胺（primary secondary amine ，PSA）、C18 等吸附劑對基質中的雜質進行進一步凈化。其中，MgSO4可除去提取液中少量水分；GCB 可以通過自身結構吸附干擾物質；PSA 通過胺基的弱離子交換作用和極性基質成分形成氫鍵，可有效去除色素、糖類、有機酸等；C18 主要依靠非極性相互作用吸附脂肪等物質。

本試驗選用6 種不同配比的吸附劑組合，分別為吸附劑組合1（0.1 g MgSO4+0.1 g PSA+0.1 g C18）、吸附劑組合2（0.15 g MgSO4+0.1 g PSA+0.05 g C18）、吸附劑組合3（0.15 g MgSO4+0.2 g PSA+0.1 g C18）、吸附劑組合4（0.2 g MgSO4+0.15 g PSA+0.15 g C18）；吸附劑組合5（0.2 g MgSO4+0.2 g PSA+0.1 g C18+0.1 g GCB）；吸附劑組合6（0.15 g MgSO4+0.1 g PSA+0.15 g C18+0.2 g GCB）。在其他試驗條件相同的情況下，分別向陰性基質中添加20 ng/mL 混合標準溶液，通過比較大麻酚、大麻二酚、四氫大麻酚的回收率來確定最佳吸附劑組合，結果見圖3。

圖3 不同吸附劑組成對3 種大麻酚提取效率的影響Fig.3 Effect of different adsorbent combinations on the extraction efficiency of three cannabinoids

由圖3 可知，吸附劑組合2 在餅干基質中均呈現出最佳的凈化效果，3 種物質的回收率為82.1%～85.4%。因此本試驗選擇吸附劑組合2（0.15 g MgSO4+0.1 g PSA+0.05 g C18）作為吸附劑。同時也看到加入GCB 降低了3 種目標化合物的回收率，這是因為GCB是6 個碳原子構成的平面六角形，對平面苯環結構的化合物有較強的吸附作用，大麻酚、大麻二酚和四氫大麻酚三者均有平面苯環結構。吸附劑中加入GCB 會吸附溶液中的大麻酚類物質，降低回收率。

2.4 基質效應評價

在液相色譜質譜檢測中，基質效應普遍存在，影響定量結果的準確性，APCI 替換ESI 在一定程度上可以消除基質效應，提高定量準確度。基質效應（matrix effect，ME）計算方法為ME=A/B-1，式中，A 為基質標準曲線斜率；B 為溶劑標準曲線斜率。當ME＞0，表明基質效應增強；ME＜0，表明基質效應抑制；|ME|=0 表示不存在基質效應；|ME|＜0.2 為弱基質效應；0.2≤|ME|≤0.5為中等基質效應；|ME|＞0.5 為強基質效應。不同電離模式下的基質效應如表5 所示。

表5 不同電離模式下的基質效應Table 5 Matrix effects under different ionization modes

由表5 可知，使用ESI 源檢測3 種大麻酚，三者均呈現中等基質效應，但在APCI 下三者呈弱基質效應。APCI 的使用大大降低了3 種化合物的基質效應。在相關研究中認為在利用液相色譜串聯質譜進行檢測分析時，ESI 源比APCI 源更容易出現基質效應[21]。

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性方程與檢出限、定量限

以3 倍信噪比確定方法檢出限，以10 倍信噪比確定定量限，大麻酚、大麻二酚、四氫大麻酚的線性關系及檢測靈敏度如表6 所示。

表6 大麻酚、大麻二酚、四氫大麻酚的線性關系及檢測靈敏度Table 6 Linear relationship and detection sensitivity of cannabinol，cannabidiol，and tetrahydrocannabinol

2.5.2 回收率與相對標準偏差

取空白樣品，選擇低5 ng/mL、中20 ng/mL、高100 ng/mL 3 個濃度進行添加回收試驗，重復6 次，回收率及相對標準偏差如表7 所示。

表7 方法回收率和相對標準偏差（n=6）Table 7 Method recovery rate and relative standard deviation（n=6）

由表6、表7 可知，該方法的精密度和準確性良好。

2.6 實際樣品測試

從市場上采集了8 份餅干樣品，經測定均未檢出大麻酚、大麻二酚和四氫大麻酚。

3 結論

本研究采用液相色譜串聯質譜技術對餅干中大麻酚、大麻二酚、四氫大麻酚進行了痕量檢測。研究首次采用APCI 源替代ESI 源，大大降低了基質效應。通過優化提取溶劑、超聲時間、萃取鹽包組成、吸附劑用量搭配等QuEChERS 前處理條件規避了傳統液相色譜法檢出限高、樣品處理復雜等問題。該方法簡便快速，結果準確性高，適合于餅干中大麻酚、大麻二酚、四氫大麻酚的測定。