大蒜素微乳劑高效液相色譜分析方法研究

王玉萍，付萍萍，蒲 時，姜軍俠

（陜西省農(nóng)業(yè)檢驗檢測中心，陜西 西安 710003）

1 前言

大蒜素是以大蒜為原料提取的產(chǎn)品，也可化工合成，是一種具有刺激性氣味的有機硫化合物，化學(xué)名為二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚，是大蒜中主要的殺菌成分［1-2］。目前作為飼料添加劑使用的大蒜素絕大部分是化工合成的產(chǎn)物。農(nóng)業(yè)上用作殺蟲、殺菌劑，也用于飼料、食品、醫(yī)藥上［3］。

對于在農(nóng)業(yè)種植方面，也有大量研究表明大蒜素對于大部分植物的細菌性病害都具有較好的防治效果，同時對于真菌病害也具有一定的防效。根據(jù)研究報道科學(xué)使用大蒜素防治辣椒炭疽病，防效可與多菌靈相當(dāng)，達到80%左右。在國外已經(jīng)有不少大蒜素登記的農(nóng)藥，廣泛應(yīng)用于果樹、蔬菜、鮮花等作物上防治病害和蟲害。在農(nóng)藥殘留方面，大蒜素是一種天然植物源農(nóng)藥，與人類日常飲食密切相關(guān)；施藥量低，植物中殘留量遠低于人體每日從大蒜中攝取量，在自然環(huán)境中易降解，國內(nèi)外未對大蒜素最大殘留限量做出規(guī)定，在我國對其使用安全性高度認可，且至今未發(fā)現(xiàn)有大蒜素在作物上超標(biāo)而引起人體危害的情況。

2 試驗部分

2.1 試劑和溶液 甲醇：色譜純；乙腈：色譜純；水：新蒸二次蒸餾水或超純水；二烯丙基二硫醚標(biāo)樣：已知質(zhì)量分數(shù)，ω≥89.0%；二烯丙基三硫醚標(biāo)樣：已知質(zhì)量分數(shù)，ω≥90.9%；（ChromaDex）；5%大蒜素微乳劑。

2.2 儀器 高效液相色譜儀：Agilent 1260，具有二極管陣列檢測器和自動進樣器；Agilent 色譜工作站；色譜柱：150 mm×4.6 mm（i.d.）不銹鋼柱，內(nèi)裝ZORBAX SB-C18、5μm填充物。

2.3 液相色譜操作條件 流動相：Ψ（乙腈∶水）＝60∶40，經(jīng)濾膜過濾，并進行脫氣；流量：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：230 nm；進樣體積：5μL；保留時間：二烯丙基二硫醚約7.6 min；二烯丙基三硫醚約12.2 min。典型的大蒜素的標(biāo)樣、樣品色譜圖（圖1、2、3）。

圖1 二硫醚標(biāo)樣色譜圖

圖2 三硫醚標(biāo)樣色譜圖

圖3 大蒜素5%微乳劑試樣液相色譜圖

2.4 測定步驟

2.4.1 標(biāo)樣溶液的配制 分別稱取0.05 g（精確至0.000 1 g）二硫醚和三硫醚標(biāo)樣于2 個100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超聲波振蕩5 min，冷卻至室溫。

2.4.2 試樣溶液的配制 稱取含0.05 g（精確至0.000 1 g）大蒜素的試樣于100 mL 容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度并搖勻，超聲波振蕩5 min，冷卻至室溫，過濾。

2.4.3 測定 在上述操作條件下，在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰2 針二硫醚或三硫醚峰面積相對變化＜1.2%時，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進行測定。

2.4.4 計算 將測得的2 針試樣溶液以及試樣前后2 針標(biāo)樣溶液中二硫醚或三硫醚峰面積分別進行平均。試樣中二硫醚或三硫醚的質(zhì)量分數(shù)按式（1）計算，兩者質(zhì)量分數(shù)之和即為大蒜素質(zhì)量分數(shù)：

式中：

ω1——試樣中二硫醚或三硫醚的質(zhì)量分數(shù)，%；

A2——試樣溶液中二硫醚或三硫醚峰面積的平均值；

m1——標(biāo)樣的質(zhì)量的數(shù)值，g；

ω——標(biāo)樣中二硫醚或三硫醚的質(zhì)量分數(shù)，%；

A1——標(biāo)樣溶液中二硫醚或三硫醚峰面積的平均值；

m2——試樣的質(zhì)量的數(shù)值，g。

3 結(jié)果分析

3.1 色譜條件選擇 色譜柱選擇常用的ZORBAX SB-C18反相柱。根據(jù)大蒜素物化性質(zhì)、溶劑的紫外吸收波長和成都新朝陽作物科學(xué)有限公司的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，選擇甲醇作為溶劑溶解樣品，并以乙腈和水作為流動相。為了得到更好的分離效果和峰形，將流動相按不同比例在色譜柱上進行試驗，當(dāng)Ψ（乙腈∶水）=60∶40 作為流動相，流速1.0 mL/min，該條件下，二硫醚和三硫醚色譜峰峰形較好，峰純度＞990，與雜質(zhì)能完全分離，具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，并且分析時間較短，提高了工作效率。

3.2 檢測波長的選擇 通過Agilent 1260 高效液相色譜儀的光譜數(shù)據(jù)采集功能，二硫醚、三硫醚的紫外光譜圖（圖4、5），從圖中可以看到二硫醚和三硫醚的最大吸收波長均約為190 nm，190 nm屬于低波長段，靈敏度雖高，但干擾較大，故選擇230 nm 作為檢測波長，靈敏度較好，且干擾小，能滿足分析要求。

圖4 二硫醚的紫外光譜圖

圖5 三硫醚的紫外光譜圖

3.3 分析方法的線性相關(guān)性試驗 按2.4.1 標(biāo)樣溶液的制備方法配制5 個不同濃度的有效成分線性相關(guān)溶液，分別標(biāo)記為STD1 至STD5。在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，按照STD1 至STD5 的順序測定每個溶液中二硫醚或三硫醚的峰面積，取2 次測定的平均結(jié)果。以二硫醚或三硫醚質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果（表1、2）、（圖6、7）。

表1 二硫醚線性范圍的測定

表2 三硫醚線性范圍的測定

圖6 二硫醚峰面積與質(zhì)量濃度關(guān)系圖

圖7 三硫醚峰面積與質(zhì)量濃度關(guān)系圖

從表1～2和圖6～7可以看出，當(dāng)二硫醚質(zhì)量濃度在280.4～654.2 mg/L 之間（進樣體積5μL），三硫醚質(zhì)量濃度在128.2～542.5 mg/L 之間（進樣體積5 μL），與相應(yīng)的峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，計算得回歸方程為y二硫醚=7.330 3x+99.808、y三硫醚=14.113x-204.16，相關(guān)系數(shù)r二硫醚=0.999 9、r三硫醚=0.996 1 完全可以滿足定量分析要求。本方法中二硫醚和三硫醚標(biāo)樣質(zhì)量濃度分別為467.3、339.1 mg/L（進樣體積5μL）。

3.4 分析方法的精密度試驗 按2.4.2 試樣溶液的制備方法配制5 個5%大蒜素微乳劑精密度溶液，以有效成分線性相關(guān)溶液STD3 為標(biāo)樣溶液，在上述操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，按照標(biāo)樣溶液、精密度溶液、精密度溶液、標(biāo)樣溶液的順序進行測定，結(jié)果（表3）。

表3 分析方法的精密度試驗結(jié)果

3.5 分析方法的準(zhǔn)確度試驗 稱取含0.025 g（精確至0.000 1 g）大蒜素的5%大蒜素微乳劑于100 mL 容量瓶中，再分別加入二硫醚的標(biāo)樣0.025 g 和三硫醚標(biāo)樣0.015 g，按2.4.2 試樣溶液的制備方法配制5 個有效成分準(zhǔn)確度溶液，以線性相關(guān)溶液STD3 為標(biāo)樣溶液，在上述操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，按照標(biāo)樣溶液、準(zhǔn)確度溶液、準(zhǔn)確度溶液、標(biāo)樣溶液的順序進行測定，結(jié)果（表4）。

表4 分析方法的準(zhǔn)確度試驗結(jié)果

3.6 方法特異性 本試驗采用HPLC-DAD 峰純度分析法來鑒別大蒜素。大蒜素標(biāo)樣、5%大蒜素微乳劑的大蒜素HPLC-DAD 峰純度均＞990，有效成分處無其它物質(zhì)干擾，符合定量分析要求。峰純度色譜圖（圖8～11）。

圖8 二硫醚標(biāo)樣HPLC-DAD峰純度色譜圖

圖9 三硫醚標(biāo)樣HPLC-DAD峰純度色譜圖

圖10 5%大蒜素微乳劑中二硫醚HPLC-DAD峰純度色譜圖

圖11 5%大蒜素微乳劑中三硫醚HPLC-DAD峰純度色譜圖

4 結(jié)論

本文建立了檢測大蒜素微乳劑中有效成分質(zhì)量分數(shù)的高效液相色譜分析方法。試驗結(jié)果表明，大蒜素在測試濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，有較高的準(zhǔn)確度和精密度，具有分離效果好，分析時間短，操作簡便等特點，符合定量分析要求，是一種高效、快速、準(zhǔn)確的分析方法。