乳酸菌與酵母菌互作對(duì)蘿卜泡菜發(fā)酵進(jìn)程及風(fēng)味品質(zhì)的影響

黃玉立，葛黎紅，馬思堯，梅 源，盧 偉，趙 楠*

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066；2.四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101；3.四川老壇子食品有限公司，四川 眉山 620010）

泡菜是以乳酸菌為主發(fā)酵而成的一種“冷加工”蔬菜制品。在厭氧的環(huán)境條件中，乳酸菌作為優(yōu)勢(shì)菌群不斷生長(zhǎng)并生成有機(jī)酸等一系列代謝產(chǎn)物，賦予泡菜獨(dú)特的口感[1]；酵母菌在泡菜中含量較少，也不是優(yōu)勢(shì)菌群，研究過程其重要性常被忽略，但研究表明酵母在發(fā)酵過程產(chǎn)生的乙醇不但有效的抑制泡菜生花，還能與有機(jī)酸等物質(zhì)反應(yīng)生成酯類等芳香物質(zhì)，豐富了泡菜的香氣[2]。且過去研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬（Lactobacillus）和哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）是泡菜中的主要乳酸菌屬和酵母屬[3]。

乳酸菌和酵母菌處于同一發(fā)酵體系中，可以通過代謝產(chǎn)物交換或者細(xì)胞交流實(shí)現(xiàn)微生物種間的相互作用[4-5]。已有關(guān)于酸奶[6]、酸面團(tuán)[7]、開菲爾乳[8]等的研究表明，酵母菌在富含氮源的生長(zhǎng)環(huán)境中，其TORC1信號(hào)通路受到刺激，代謝產(chǎn)生的氨基酸可為乳酸菌提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)[9]；而乳酸菌分解乳糖所產(chǎn)生的葡萄糖和半乳糖同時(shí)可被酵母菌利用[10]。乳酸菌和酵母菌的代謝互補(bǔ)機(jī)制使得微生物即使處于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較匱乏的發(fā)酵環(huán)境中仍然能夠生長(zhǎng)，使得復(fù)雜體系發(fā)酵過程更加高效、穩(wěn)定和可控[11]。泡菜作為典型的多菌種參與的復(fù)雜發(fā)酵體系，目前合成微生物群落的研究已經(jīng)受到研究者的關(guān)注[12]。泡菜中關(guān)注點(diǎn)對(duì)于乳酸菌與乳酸菌或環(huán)境因素之間的影響或關(guān)系較多，然而關(guān)于泡菜中乳酸菌與酵母的互作對(duì)發(fā)酵進(jìn)程和品質(zhì)的影響研究還較少，仍需要深入探究。

因此，該研究通過采用無菌鹽水發(fā)酵蘿卜作為對(duì)照組，分別接種了植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）、甘草乳桿菌（Liquorilactobacillus nagelii）和少孢哈薩克斯坦酵母（Kazachstania exigua）單菌和混菌于蘿卜泡菜中，測(cè)定了發(fā)酵過程中蘿卜泡菜鹵水的微生物數(shù)量（乳酸菌數(shù)量、酵母菌數(shù)量和菌落總數(shù)）和理化參數(shù)（pH、總酸、還原糖、亞硝酸鹽）。通過頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（headspace-solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）方法檢測(cè)發(fā)酵終點(diǎn)泡蘿卜的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，使用正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）和層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）方法分析了風(fēng)味化合物差異，解析了乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵對(duì)蘿卜泡菜風(fēng)味的影響，以期為泡菜工業(yè)化生產(chǎn)過程中品質(zhì)提升提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

新鮮紅皮蘿卜：成都市錦江區(qū)某果蔬市場(chǎng)。

植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）（Lp）、甘草乳桿菌（Liquorilactobacillus nagelii）（Ln）與少孢哈薩克斯坦酵母（Kazachstania exigua）（Ke）：篩分自泡菜鹵水，并保存于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所微生物菌種保藏庫(kù)。

1.1.2 試劑

氯化鈉、鹽酸：成都金山化學(xué)試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸：廣州和為醫(yī)藥科技有限公司；四硼酸鈉、α-萘乙二胺二鹽酸鹽、乙酸鋅、無水對(duì)氨基苯磺酸和亞硝酸鈉：成都市科隆化學(xué)品有限公司；亞鐵氰化鉀：成都市科龍化工試劑廠。試驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基、乳酸菌（man rogosa sharpe，MRS）培養(yǎng)基和酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SynergyTMHTX多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)博騰儀器有限公司；Centrifuge5810R冷凍離心機(jī)：艾本德（上海）國(guó)際貿(mào)易有限公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；S210SevenCompact pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；Metrohm855全自動(dòng)滴定儀：瑞士萬通有限公司；Intuvo9000-5977b氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將乳酸菌Lp和Ln分別劃線接種到MRS固體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h；酵母Ke劃線接種到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基中，于30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h。在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h之后，分別挑取Ln和Lp的單菌落接入MRS液體培養(yǎng)基中，挑取Ke的單菌落接入YPD液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行24 h的富集培養(yǎng)，使所有菌體濃度達(dá)到7（lg CFU/mL）。

1.3.2 泡菜發(fā)酵模擬培養(yǎng)液的制備

無菌紅皮蘿卜汁的制備：挑選新鮮的紅皮蘿卜進(jìn)行洗凈、切分，與純凈水按1∶1的比例混合榨汁，然后過濾掉紅皮蘿卜殘?jiān)瑢⑦^濾紅皮蘿卜汁煮沸、撇去浮沫，最后使用紗布再次進(jìn)行過濾、分裝，高壓蒸汽115 ℃、15 min滅菌后待用。用該蘿卜汁模擬泡菜發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)液作為菌種培養(yǎng)液。

1.3.3 單菌組和混菌的發(fā)酵母液制備

將Lp、Ln和Ke按照1%的接種量分別接種于模擬營(yíng)養(yǎng)液中；混菌發(fā)酵分別為L(zhǎng)p+Ke組、Ln+Ke組（1∶1）和Lp+Ln+Ke組（1∶1∶1），各組中微生物均按總接種量1%混合接種于模擬營(yíng)養(yǎng)液中，所有培養(yǎng)液于30 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h分別得到單菌和混菌發(fā)酵母液，各組處理菌體濃度均為7（lg CFU/mL）。

1.3.4 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

按照1%的總接種量分別接種1.3.3中的單菌組Lp、Ln、Ke以及混菌組Lp+Ke、Ln+Ke和Lp+Ln+Ke的菌體發(fā)酵母液于泡菜發(fā)酵模擬培養(yǎng)液中，25 ℃恒溫培養(yǎng)菌液48 h，期間每隔2 h取樣用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)600 nm條件下測(cè)定吸光度值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值（OD600nm）為縱坐標(biāo)，繪制不同處理組的生長(zhǎng)曲線。

1.3.5 蘿卜泡菜制作

將新鮮的紅皮蘿卜洗凈、晾干、切分后與4%的鹽水以1∶2的比例裝入500 mL的壇中，將1.3.3中的發(fā)酵母液各取50 mL菌液，在8 000 r/min條件下進(jìn)行離心10 min，收集離心沉淀菌體，用生理鹽水沖洗并接種于蘿卜泡菜中；CK組為無菌4%的鹽水發(fā)酵紅皮蘿卜。將制備好的蘿卜泡菜放置于25 ℃，發(fā)酵0～7 d，并在0、1 d、3 d、5 d、7 d取樣進(jìn)行理化和微生物分析，取發(fā)酵終點(diǎn)7 d的蘿卜樣品進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)。

1.3.6 理化指標(biāo)分析檢測(cè)

取發(fā)酵過程中0、1 d、3 d、5 d、7 d的蘿卜泡菜鹵水進(jìn)行理化指標(biāo)分析：采用電位法測(cè)定pH值[13]；采用酸、堿中和滴定法測(cè)定總酸[14]；采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖[15]；采用GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》的分光光度法測(cè)定亞硝酸鹽。

1.3.7 微生物分析檢測(cè)

取0.5 mL蘿卜泡菜鹵水于4.5 mL無菌生理鹽水中混合均勻，經(jīng)梯度稀釋后，分別涂布于MRS平板，厭氧條件下37 ℃經(jīng)72 h培養(yǎng)后計(jì)數(shù)乳酸菌數(shù)量，采用孟加拉紅平板，30 ℃條件下培養(yǎng)72 h后計(jì)數(shù)真菌數(shù)量，采用PCA平板，37 ℃經(jīng)72 h培養(yǎng)后計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。

1.3.8 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)[16]

（1）樣品前處理

取5 g泡蘿卜樣品，并加入1.5 g的NaCl于20 mL的頂空進(jìn)樣瓶中。

（2）GC-MS測(cè)定條件

萃取條件：50 ℃振搖加熱20 min，新萃取頭需經(jīng)270 ℃老化5 min，然后插入頂空瓶吸附30 min，隨后在氣相進(jìn)樣口250 ℃下解吸5 min。

氣相色譜條件：DB-wax色譜柱（30m×250μm×0.25μm），柱溫50 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min 的速度升至150 ℃保持3 min，以10 ℃/min升至220 ℃并保持2 min，載氣（He），流速1 mL/min，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度250 ℃，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍：35～550 m/z。

（3）定性定量

由GC-MS得到的譜圖，在美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）2001標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)的檢索及標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)進(jìn)行物質(zhì)定性，使用面積歸一化法進(jìn)行物質(zhì)的相對(duì)定量。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析，使用GraphPad Prism9.0.0軟件繪制折線圖，OPLS-DA分析使用SIMCA14.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單菌和混菌在蘿卜泡菜模擬營(yíng)養(yǎng)液中的生長(zhǎng)曲線

生長(zhǎng)曲線可以反映微生物的生長(zhǎng)速度，為探究乳酸菌和酵母互作關(guān)系對(duì)其生長(zhǎng)情況的影響，分別測(cè)定了Lp、Ln和Ke三種單菌的生長(zhǎng)曲線以及Lp+Ke、Ln+Ke、Lp+Ln+Ke混菌的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 單菌和混菌在培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)曲線Fig. 1 Growth curves of single and mixed strains in culture solution

由圖1可知，乳酸菌和酵母菌在共培養(yǎng)下，生長(zhǎng)情況較單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)有明顯差異，該研究結(jié)果同洪家麗等[17-18]的研究結(jié)果一致。在單乳酸菌體系的生長(zhǎng)曲線結(jié)果中，Lp生長(zhǎng)較Ln更快，26 h后逐漸進(jìn)入平臺(tái)期，OD600nm值不再有明顯的變化。乳酸菌和酵母菌混合體系相較于單酵母菌Ke體系延遲了4～6 h進(jìn)入平穩(wěn)期。且乳酸菌和酵母的混合體系的生長(zhǎng)速率最快，在8 h就進(jìn)入對(duì)數(shù)期。其中，3種混菌體系的吸光度值普遍比單菌體系的吸光度值高，表明乳酸菌Lp、Ln和酵母Ke共培養(yǎng)時(shí)存在互作關(guān)系，對(duì)兩類菌的生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用。

2.2 單菌和混菌接種條件下蘿卜泡菜發(fā)酵過程中微生物數(shù)量變化

單菌和混菌發(fā)酵制作蘿卜泡菜過程中微生物數(shù)量變化情況結(jié)果見圖2。

圖2 單菌和混菌發(fā)酵蘿卜泡菜過程中微生物變化情況Fig. 2 Changes of microorganisms in radish Paocai fermented by single and mixed strains during fermentation process

由圖2A和B可知，單菌組和混菌組在蘿卜泡菜發(fā)酵過程中細(xì)菌和乳酸菌數(shù)量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加差異逐漸減小。發(fā)酵第7天時(shí)，Lp+Ln+Ke組的乳酸菌數(shù)量最高，其次是Ke單菌組，并且Lp+Ke組的乳酸菌數(shù)量比Lp單菌組的乳酸菌數(shù)量高，同時(shí)，Lp+Ln+Ke組和Lp+Ke組發(fā)酵過程中乳酸菌的數(shù)量均高于乳酸菌單菌發(fā)酵蘿卜泡菜中的乳酸菌數(shù)量，可以得出乳酸菌Lp與Ln和酵母菌Ke的混合發(fā)酵有利于促進(jìn)發(fā)酵體系中乳酸菌的生長(zhǎng)。這可能是由于酵母菌代謝產(chǎn)生的CO2、氨基酸和維生素等物質(zhì)能刺激乳酸菌的生長(zhǎng)[19]。

由圖2C可知，乳酸菌單菌組和CK組的酵母菌數(shù)量一直呈下降趨勢(shì)，且在整個(gè)發(fā)酵過程中均與接種酵母組的蘿卜泡菜中酵母菌數(shù)量存在顯著性差異（P＜0.05）。此外，混菌接種與酵母菌單菌接種發(fā)酵體系之間的酵母菌數(shù)量在發(fā)酵第3天也存在顯著性差異（P＜0.05），且發(fā)酵第7天時(shí)，混菌接種蘿卜泡菜組中的酵母菌數(shù)量較酵母菌單菌接種組更高，表明乳酸菌Ln和Lp對(duì)酵母菌Ke的生長(zhǎng)起到一定促進(jìn)作用。研究表明，乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸過多會(huì)抑制酵母生長(zhǎng)，但適量的乳酸能螯合陽離子，減輕體系中陽離子對(duì)酵母菌細(xì)胞的影響[20-21]。

2.3 單菌和混菌接種條件下蘿卜泡菜發(fā)酵過程中還原糖含量變化

還原糖是泡菜中的微生物的主要碳源物質(zhì)，單菌和混菌發(fā)酵蘿卜泡菜過程中的還原糖含量變化見圖3。

圖3 單菌和混菌發(fā)酵蘿卜泡菜過程中還原糖變化情況Fig.3 Changes of reducing sugar contents in radish Paocai fermented by single and mixed strains during fermentation process

由圖3可知，Lp、Ke組和其他混菌組發(fā)酵蘿卜泡菜在發(fā)酵周期內(nèi)還原糖含量都呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。而Ln和CK組還原糖含量在發(fā)酵周期中的變化不同于其它組別，在0～5 d無明顯變化，5～7 d呈增加趨勢(shì)，表明CK組和Ln組中的微生物對(duì)還原糖的消耗速度小于紅皮蘿卜中還原糖的溶出速度，此現(xiàn)象和Ln的生長(zhǎng)速率有關(guān)（見圖1）。Lp組在3～5 d過程中還原糖的增加速度高于其他組，此現(xiàn)象結(jié)合Lp的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸情況可以說明Lp在蘿卜泡菜發(fā)酵體系中3～5 d時(shí)生長(zhǎng)較快，期間代謝產(chǎn)物如乳酸、纖維素酶積累量增加，對(duì)植物細(xì)胞壁破壞更快，植物中的還原糖溶出速度也更快[22]。但乳酸菌相較于酵母菌對(duì)還原糖的利用更慢，5～7 d還原糖的降低速度明顯含有酵母Ke組的要更快，且發(fā)酵第7天時(shí)Lp+Ln+Ke組、Ln+Ke組和Ke組的還原糖基本消耗殆，與CK組、Ln組和Lp組存在顯著性差異（P＜0.05）。相比于單菌發(fā)酵，混合菌發(fā)酵蘿卜泡菜消耗還原糖速率更快，表明混菌發(fā)酵更能提高蘿卜泡菜的發(fā)酵速率。

2.4 單菌和混菌接種條件下蘿卜泡菜發(fā)酵過程中pH和總酸變化

pH和總酸反映的是泡菜發(fā)酵過程中的產(chǎn)酸情況和乳酸菌的產(chǎn)酸能力，單菌和混菌發(fā)酵蘿卜泡菜過程中pH和總酸（以乳酸計(jì)）含量的變化情況見圖4。

圖4 單菌和混菌發(fā)酵蘿卜泡菜過程中pH（A）和總酸（B）變化情況Fig. 4 Changes of pH (A) and total acid (B) in radish Paocai fermented by single and mixed strains during fermentation process

由圖4A可知，各處理組下蘿卜泡菜的pH值均隨著發(fā)酵的進(jìn)行而逐漸降低。其中Lp+Ln+Ke組在7個(gè)處理組中表現(xiàn)出了最快的產(chǎn)酸進(jìn)程，發(fā)酵3 d后pH降至4.50以下，發(fā)酵第7天時(shí)蘿卜泡菜產(chǎn)品的pH為3.53，表現(xiàn)出了較好的發(fā)酵產(chǎn)酸效果。由圖4B可知，7個(gè)組的蘿卜泡菜在整個(gè)發(fā)酵周期中的總酸含量都呈逐漸上升的趨勢(shì)，與pH的變化趨勢(shì)相符。在發(fā)酵3 d后，總酸的增加趨勢(shì)表現(xiàn)出了差異，其中含有Lp的發(fā)酵組總酸含量普遍較高，說明植物乳桿菌為發(fā)酵蘿卜泡菜中主要的產(chǎn)酸菌之一。同時(shí)，三個(gè)混菌組在發(fā)酵第7天時(shí)的總酸含量普遍高于單菌組及CK組，其中產(chǎn)酸效果最好的體系是Lp+Ln+Ke混菌體系，在第7天時(shí)總酸含量達(dá)0.31 mL/100 mL，達(dá)到較佳的即食效果[23]。結(jié)果說明，兩菌、三菌混合發(fā)酵可以協(xié)同產(chǎn)酸，提高了蘿卜泡菜的發(fā)酵進(jìn)程。

2.5 單菌和混菌接種條件下蘿卜泡菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量變化

亞硝酸鹽是泡菜中的安全指標(biāo)之一，單菌和混菌發(fā)酵蘿卜泡菜過程中亞硝酸鹽含量的變化情況見圖5。由圖5可知，CK組在發(fā)酵第3天出現(xiàn)亞硝峰含量高達(dá)12.34 mg/kg，雖低于國(guó)家對(duì)醬腌菜中亞硝酸鹽的限量要求（不超過20 mg/kg），但顯著高于其他組（P＜0.05）。Ln+Ke組和Lp+Ke組在發(fā)酵第1天出現(xiàn)亞硝峰，含量略高于其余單菌組和三菌混合組，隨后與其余接菌組的亞硝酸鹽含量接近，且在發(fā)酵第5天之后所有接菌組的亞硝酸鹽含量基本都接近于0。乳酸菌具有降解亞硝酸鹽的基因[24]，因此接種發(fā)酵可在5 d后可獲得幾乎不含亞硝酸鹽的蘿卜泡菜。

圖5 單菌和混菌發(fā)酵蘿卜泡菜過程中亞硝酸鹽含量變化情況Fig. 5 Changes of nitrite contents in radish Paocai fermented by single and mixed strains during fermentation process

2.6 單菌和混菌接種條件下蘿卜泡菜發(fā)酵終點(diǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是泡菜風(fēng)味的重要組成部分，為了探究乳酸菌與酵母互作發(fā)酵對(duì)蘿卜泡菜揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，利用HS-SPME-GC-MS對(duì)7組處理發(fā)酵第7天的蘿卜泡菜揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)到包括酯類、醇類、醚類、酸類、醛酮類等109種風(fēng)味物質(zhì)。以化合物含量指標(biāo)為變量X，不同發(fā)酵組樣本作為分類變量Y，對(duì)發(fā)酵第7天的7組樣品進(jìn)行OPLS-DA。結(jié)合化合物在圖中的分布差異以及HCA能夠獲得不同組中的差異代謝物[25]，結(jié)果見圖6。

圖6 單菌和混菌發(fā)酵蘿卜泡菜第7天的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)正交偏最小二乘法判別分析（A）和層次聚類分析（B）Fig. 6 Orthogonal partial least squares-discriminant analysis (A) and hierarchical clustering (B) of volatile flavor compounds of radish Paocai fermented by single and mixed strains on the 7th day

模型中R2和Q2分別代表模型可解釋的變量和可預(yù)測(cè)度，可對(duì)模型的優(yōu)劣進(jìn)行判別，理論上擬合優(yōu)度（R2）、預(yù)測(cè)優(yōu)度（Q2）數(shù)值越接近1，說明模型越好，越低說明模型的擬合準(zhǔn)確性越差。通常情況下，R2、Q2高于0.5較好，高于0.4可接受，Q2在Y軸的截距小于0.05，可認(rèn)為模型沒有出現(xiàn)過擬合。

由圖6A可知，模型對(duì)X軸的解釋度（R2X）為0.734、模型對(duì)Y軸的解釋度（R2Y）為0.97、Q2（cum）為0.804，置換檢驗(yàn)結(jié)果顯示R2=0.508，Q2=-0.764，表明該模型穩(wěn)定可靠[25]。圖6A中的CK組和單乳酸菌組的風(fēng)味物質(zhì)主要集中在醛酮類物質(zhì)和烴類物質(zhì)周圍，其中三芥子酸甘油酯和二甲基三硫?yàn)槭只剖卟耍ㄈ缂t皮蘿卜）的特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，表明發(fā)酵進(jìn)程緩慢，發(fā)酵不完全[26]。單乳酸菌組與含有酵母菌的發(fā)酵組的風(fēng)味輪廓?jiǎng)t表現(xiàn)出明顯差異，含有酵母菌的發(fā)酵組風(fēng)味物質(zhì)種類更加豐富。且圖6A和圖6B中的Ke組和Ln+Ke組均與第三主成分呈正相關(guān)且聚類在第二分支，風(fēng)味成分結(jié)構(gòu)更相似，周圍含有具有強(qiáng)烈芳香氣味的正辛醇和具有水果香味的庚醛，這可能與酵母菌發(fā)酵代謝、蛋白質(zhì)分解及氨基酸的代謝有關(guān)[27]，但依舊含有紅皮蘿卜本身的辛辣刺激風(fēng)味物質(zhì)，如二甲基二硫等[26]。Lp+Ke組和Lp+Ln+Ke組的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在HCA中分離于其他組，物質(zhì)主要集合在第二象限，有3-己烯-1-醇、異戊醇、苯乙醇、正丁酸、硫代乙酸甲酯、丁酸甲硫醇酯等，這可能由于Lp代謝更快，與Ke互作會(huì)促進(jìn)酸和醇類物質(zhì)生成酯類物質(zhì)，從而提升蘿卜泡菜的復(fù)合香氣。值得注意的是乙酸乙酯僅在Lp+Ln+Ke組中檢測(cè)到，表明多乳酸菌與酵母菌互作更有利于酯類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生。由圖6B可知，CK組、Ln組和Lp組在HCA中都在第一分支，揮發(fā)性成分特征趨于一致。研究表明相較于單菌種，多菌種微生物群落具有更廣泛的代謝靈活性，菌種間的溝通和交流增強(qiáng)能更有效地催化許多復(fù)雜代謝過程，對(duì)待外界環(huán)境的擾動(dòng)具有更高的抵抗性[28-29]。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用鹽水發(fā)酵蘿卜作為對(duì)照組，分別接種Lp、Ln和Ke單菌，Lp+Ke、Ln+Ke、Lp+Ln+Ke混菌作為菌種發(fā)酵蘿卜泡菜，并在發(fā)酵過程中測(cè)定不同接種發(fā)酵方式下蘿卜泡菜的微生物數(shù)量、理化指標(biāo)以及發(fā)酵終點(diǎn)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。單菌和混菌接種發(fā)酵蘿卜泡菜在發(fā)酵過程中，經(jīng)不同微生物群落的代謝作用，理化指標(biāo)的變化存在顯著差異，主要體現(xiàn)在混菌發(fā)酵的糖代謝速率和產(chǎn)酸速率更快。在揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)方面，混菌發(fā)酵可以豐富蘿卜泡菜的風(fēng)味化合物組成，其中乙酸乙酯僅在Lp+Ln+Ke組中檢測(cè)到。多乳酸菌與酵母菌互作發(fā)酵，增加了揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類，可以提高蘿卜泡菜的復(fù)合香。酵母和不同的乳酸菌混合發(fā)酵表現(xiàn)出的理化性質(zhì)以及風(fēng)味代謝上均有差異。OPLS-DA和HCA結(jié)果表明，可以將不同菌種發(fā)酵的泡菜進(jìn)行有效區(qū)分。因此，酵母菌和多乳酸菌互作體系具有發(fā)酵產(chǎn)酸速度快、風(fēng)味成分更豐富的優(yōu)勢(shì)，為提升泡菜品質(zhì)提供一定的理論依據(jù)。