基于HS-SPME-GC-MS分析不同龍眼果酒中香氣成分

徐 佳，李嘉俊，朱文海，彭 萱，梁麗寶，傅 力*

（1.漯河食品職業學院 食品檢測系，河南 漯河 462000；2.韓山師范學院 生命科學與食品工程學院，廣東 潮州 521041）

龍眼（Dimocarpus longanLour.）屬于無患子科（Sapindaceae Juss.）植物，主要分布在我國南部及西南部地區，是廣西、廣東、福建、海南等地的主要栽培果樹之一[1]。龍眼的營養價值高，有“南方人參”之稱，其肉為白色，味甘、性平、無毒，具有抗菌、抑癌、降脂護心、增強記憶力及延緩衰老等功效[2]。近年來，關于龍眼品質的國內研究報道較多，張義[3]對不同地區、不同品種的龍眼汁香氣成分進行研究，確定反式-羅勒烯、D-檸檬烯、γ-松油烯和乙醇這4種主要的揮發性物質是龍眼中的香氣活性物質，這對采摘后龍眼的深加工處理提供了有利的參考價值，為龍眼香氣成分的研究奠定了基礎。高蓓[4]優化了采用固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）法檢測龍眼汁香氣成分的條件，同時分析了不同品種龍眼汁香氣成分以及它們和呈味物質的相關性，結果表明，糖、酸主要與萜烯類和醇類物質呈現一定的相關性。

果酒可以提高水果營養成分的利用率及附加值。目前對龍眼果酒的研究報道集中在龍眼果酒的風味物質、生產工藝及抗氧化活性等方面。邱松山等[5]采用二氯甲烷萃取龍眼酒中的香氣成分，利用氣相色譜-質譜聯用（gas chro matography-mass spectrometry，GC-MS）鑒定出龍眼酒中含有49種揮發性物質，主要風味物質有2,3-丁二醇、苯乙醇、乙酸乙酯；姚榮清等[6]采用正交試驗法優選出龍眼酒最佳發酵條件為發酵溫度21 ℃，接種量0.20 g/L，糖度25%，檸檬酸添加量6 g/L，發酵時間10 d；冉娜等[7]研究表明，不同酵母對龍眼酒質量有不同影響，酵母性狀的好壞直接影響果酒的口感和風味；何思蓮等[8]研究表明，發酵能夠促使龍眼中的活性成分更好地溶出，增加果酒中的抗自由基能力，提高機體免疫機能；劉佳藝等[9]研究發現，龍眼酒經過發酵后，具有良好的抗氧化能力，能有效清除2,2'-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate），ABTS）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基并展現出較高的還原能力。因此，分析不同酵母發酵果酒的香氣成分，篩選出關鍵性香氣成分，對優化發酵工藝、提高果酒品質具有重要的參考意義，也能夠為龍眼果酒的生產和加工提供一定的技術和理論基礎。

本研究以新鮮龍眼為原料，選用了三種不同酵母進行發酵，采用頂空固相微萃取（head space-solid-phase microex traction，HS-SPME）富集釀造的龍眼果酒中的香氣成分，利用氣相色譜-質譜法（GC-MS）對其香氣成分進行定性定量分析，結合相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）篩選關鍵性香氣成分，以明確不同酵母釀造的龍眼果酒的香氣品質特征，探究不同酵母所產生的香氣品質差異形成的物質基礎，以期為不同酵母釀造龍眼果酒品質的化學判別、感官評價及龍眼果酒香氣品質形成機理等研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍眼：市售；釀酒酵母（LABA、L-EL、CRI）：安琪酵母股份有限公司；檸檬酸、蔗糖：天津市富宇精細化工有限公司；氫氧化鈉標準溶液：天津市大茂化學試劑廠；無水乙醇、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、鹽酸：西隴科學股份有限公司；冰乙酸、葡萄糖：廣州化學試劑廠；酚酞、氯化鈉：天津市福晨化學試劑廠。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

7890A-5977A氣質聯用儀：安捷倫科技有限公司；1300 SERIES A2凈化工作臺：賽默飛世爾科技有限公司；ZHWY-2102C恒溫搖床培養箱：上海智城分析儀器制造有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；SCM-1000手持糖度折光儀：韓國HM公司；SPME萃取頭（DVB/CAR/PDMS）：美國Supelco公司；PHS-3E酸度計：上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 龍眼果酒釀造工藝流程及操作要點

操作要點：挑選龍眼，用清水清洗，去殼去核后切塊打漿，以水與龍眼果漿的比例為1∶1加水，添加白砂糖將發酵醪總糖提高至22%，同時加入4 g/L檸檬酸調至pH5.0，巴氏殺菌（90 ℃水浴20 min），冷卻至25 ℃左右。將0.15 g LABA、CRI和L-EL釀酒酵母分別溶于3 mL 5%蔗糖溶液中，于30 ℃、120 r/min恒溫搖床中培養30 min活化，得到酵母活化液，然后將酵母活化液接種至龍眼果漿中進行主發酵（25 ℃、5 d），然后進行后發酵（20 ℃、25 d），發酵完成后分離酒腳得原酒，加入0.6 g/L的皂土澄清龍眼果酒，硅藻土過濾，自然陳釀3個月，即得龍眼果酒成品。

1.3.2 龍眼果酒香氣成分分析

龍眼果酒香氣成分采用HS-SPME-GC-MS進行分析[5]。

取15 mL的龍眼果酒于30 mL樣品瓶中，加入5 g NaCl，用聚四氟乙烯-硅膠隔墊加蓋密封，40 ℃平衡15 min，然后將老化（270 ℃，1 h）的DVB/CAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶，頂空萃取45 min，攪拌速率300 r/min。

氣相色譜條件：DB-23色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣口溫度270 ℃，不分流進樣，45 s后打開分流，分流比10∶1，流速20 mL/min。程序升溫為35 ℃保持3 min，然后以3 ℃/min的速率升高至205 ℃，保留5 min。

質譜條件：采用電子電離（electronic ionization，EI）源，溶劑延遲4.9～8.0 min，離子源溫度為230 ℃，傳輸線溫度為240 ℃。

定性定量分析：將化合物與美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）數據庫檢索識別時，選擇化合物匹配度＞50，確定化合物保留時間。定量分析采用峰面積歸一法計算各成分的相對百分含量。

1.3.3 龍眼果酒香氣成分相對氣味活度值計算與評價

采用相對氣味活度值（ROAV）評價揮發性成分對龍眼果酒香氣體系的貢獻度[10]。ROAV計算公式如下：

式中：ROAVi為某一香氣組分的相對氣味活度值；Ci為某一香氣組分的相對含量，%；Cmax為香氣體系中貢獻最大組分的相對含量，%；Ti為該組分的香氣閾值；Tmax為香氣體系中貢獻最大組分的香氣閾值。

所有揮發性成分ROAV≤100，對于某一種確定組分，ROAV越大，則該物質對龍眼果酒香氣體系貢獻度越大。ROAV≥1的化合物為關鍵香氣成分，0.01≤ROAV＜1.00為修飾香氣成分，ROAV＜0.01為潛在香氣成分[10]。

1.3.4 理化指標的檢測

總酸、總糖、酒精度、總酯：按照國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[11]進行測定。

1.3.5 數據處理

對GC-MS Chemistry Station工作站采集到的原始數據采用Masshunter Qualitative Analysis軟件進行分析，利用SPSS Statistics 25.0進行鄧肯單因素方差分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同酵母發酵龍眼果酒理化指標檢測結果

由表1可知，龍眼果酒主發酵的總酸含量（8.60～8.62 g/L）、酒精度（8.12%vol～11.77%vol）均低于后發酵的總酸含量（8.66～8.91 g/L）、酒精度（11.20%vol～11.95%vol）。相反，龍眼果酒主發酵的總糖含量高于后發酵。由此可知，隨著龍眼果酒發酵時間的延長，果酒中總酸、酒精度不斷增加；而龍眼果酒中總糖含量不斷減少。因為糖在發酵過程中會轉化成酒精，故主發酵的總糖含量比后發酵的總糖含量高，不同發酵階段的總糖含量是判斷龍眼果酒發酵程度的重要依據。隨著發酵程度的加深，CRI消耗糖的速度加快，同時酒精度升高的速度也加快。與其他2種酵母相比，CRI釀酒酵母發酵更為徹底，產酒精能力較強，更適合龍眼果酒的發酵。

表1 LABA、CRI、L-EL酵母發酵的龍眼果酒理化指標檢測結果Table 1 Determination results of physicochemical indexes of longan fruit wine fermented by yeast LABA, CRI, L-EL

2.2 不同酵母發酵龍眼果酒中的香氣成分分析

由表2可知，LABA酵母發酵果酒共檢出揮發性成分32種，其中，酯類12種、醇類4種、醛類3種、烯類1種、酸類2種、醚類1種，其他類9種；CRI酵母發酵果酒共檢出揮發性成分43種，其中，酯類14種、醇類5種、醛類5種、烯類1種、酸類3種、醚類1種，其他類14種；L-EL酵母發酵果酒共檢出揮發性成分39種，其中，酯類14種、醇類4種、醛類3種、酸類1種、醚類3種，其他類14種。3種龍眼果酒中含量最高的香氣成分為醇類和酯類，其次為醚類和酸類，最少的為烯類。3種酵母發酵的龍眼果酒中，酯類種類最為豐富，醇類含量最為豐富。3種酵母發酵果酒中共同含有的酯類物質分別是正己酸乙酯、3-己烯酸乙酯、辛酸乙酯、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、水楊酸甲酯和苯乙酸乙酯；共同含有的醇類物質分別是異丁醇、苯乙醇；共同含有的醛類物質是苯甲醛；共同含有的酸類物質是乙酸；共同含有的醚類物質是二乙二醇乙醚。果酒中大部分醇類、酯類和醛類等香氣成分是通過酵母發酵產生的，這些香氣成分在發酵過程中不斷富集，互相調和，從而形成了果酒獨特的風味[19]。CRI酵母發酵果酒揮發性風味物質的種類最豐富（43種），其酯類物質含量最高（1 536.64 mg/L）。

表2 LABA、CRI、L-EL酵母發酵的龍眼果酒主要香氣成分分析Table 2 Analysis of main aroma components in longan fruit wine fermented by yeast LABA, CRI, L-EL

2.2.1 醇類分析

醇類成分是龍眼果酒中重要的風味物質，主要來源于糖類的分解代謝以及氨基酸的脫羧、脫氨反應[20]。3種龍眼果酒中檢出8種醇類物質，其中2種為共有醇類物質，分別為異丁醇和苯乙醇。異丁醇有醇油和酒精的氣味，是酒中主要的風味物質[21]，苯乙醇有蜂蜜、玫瑰和丁香花的香味[12]，在果酒中起到增香增甜及調和的作用[22]。LABA酵母發酵果酒產生的醇類成分相對含量為47.90%；CRI酵母發酵果酒產生的醇類成分相對含量為44.14%；L-EL酵母發酵果酒產生的醇類成分相對含量僅為9.61%，適宜濃度的醇類物質可以襯托酯香，對香氣的協調性有促進作用，是龍眼果酒中含量最多的香氣成分。其中，CRI酵母發酵果酒產生的異戊醇含量最高，相對含量為34.99%，為龍眼果酒帶來更加豐富的酒香和果香。

2.2.2 酯類分析

酯類成分是龍眼果酒中最豐富的香氣成分，LABA酵母發酵果酒產生的酯類有12種，相對含量為35.58%；CRI酵母發酵果酒產生的酯類有14種，相對含量為11.73%；L-EL酵母發酵果酒產生的酯類有14種，相對含量為18.10%，其中乙酯類成分居多。一般認為，在酵母脂肪酸代謝過程中產生的脂酰輔酶A醇解后產生部分脂肪酸乙酯，如丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯等[23]。含有酯類物質種類多的果酒，其風味也較豐富；酯類風味物質含量越多，其果香和花香就越濃郁。酯類物質可以增加酒體的香味，有助于酒體形成濃郁厚重的風味[24]，酸味影響果酒的口感，果酒中適量的酸類物質可以使酒有清新感和爽口感，沒有酸味的果酒品嘗起來口味比較平淡[25]。在檢測到的酯類成分中，丁酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯等都是廣泛應用于食品加工行業的食用香料，丁酸乙酯具有菠蘿香蘊的果香氣味，己酸乙酯具有菠蘿-香蕉香型的氣味，苯甲酸甲酯具有橙花及葡萄糖香氣和甜味，苯甲酸乙酯具有令人愉悅的水果香氣，苯乙酸乙酯具有花香及蜂蜜香氣味。

2.2.3 醛類分析

3種龍眼果酒檢測出醛類成分共有7種，分別是甘油縮甲醛、巴豆醛、丙烯醛、糠醛、苯甲醛、苯乙醛和4-苯基丁醛。CRI酵母發酵的龍眼果酒中醛類成分為5種，其余2種酵母發酵的龍眼果酒中醛類成分均為3種，其中苯甲醛為三種酵母在發酵過程中形成的共有醛類物質。一般認為醛類物質的產生主要來源于發酵過程中各種代謝途徑，其中包括糖代謝、脂肪酸代謝以及氨基酸代謝等。

2.2.4 其他類分析

3種龍眼果酒檢測出其他類成分主要有酚類、醛酮類、呋喃類等，共同含有的4種物質分別是萘、1-甲基萘、2-甲基萘、1-（1-乙氧基乙氧基）戊烷。其中萘和1-甲基萘有溫和芳香氣味；2-甲基萘和1-（1-乙氧基乙氧基）戊烷有令人愉快的氣味。

2.3 不同酵母發酵龍眼果酒中主要酯類成分的ROAV分析

揮發性風味物質對食品總體風味的貢獻依賴其濃度和閾值共同決定[30]，果酒中揮發性風味物質對酒體氣味有直接影響的物質主要是酯類物質[31]。3種酵母釀造龍眼果酒中的主要酯類成分的ROAV見表3。由表3可知，L-EL酵母釀造的龍眼果酒中關鍵香氣成分（ROAV≥1）有3種，分別是己酸乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二乙酯；CRI酵母釀造的龍眼果酒中關鍵香氣成分（ROAV≥1）有7種，分別是丁酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、水楊酸甲酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯；LABA酵母釀造的龍眼果酒中關鍵香氣成分（ROAV≥1）有6種，分別為丁酸乙酯、己酸乙酯、戊酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二乙酯。其中共有的關鍵香氣成分為辛酸乙酯、丁二酸二乙酯、己酸乙酯，而辛酸乙酯在3種龍眼果酒中對總體風味的貢獻度最大。與LABA和L-EL這兩種酵母相比，CRI酵母釀造的龍眼果酒中多了水楊酸甲酯和苯乙酸乙酯這2種關鍵香氣成分，水楊酸甲酯具有冬青葉香味，苯乙酸乙酯具有發酵香、花香和蜂蜜香，這兩種香氣的結合豐富了龍眼果酒醇正淡雅的特性，由此可知CRI酵母釀造的龍眼果酒香氣層次更加豐富，賦予酒體更加獨特的花香和果香特征，增加了香氣復雜性。

表3 LABA、CRI、L-EL酵母發酵的龍眼果酒主要酯類成分相對氣味活度值分析Table 3 Relative odor activity values of main esters in longan fruit wine fermented with yeast LABA, CRI, L-EL

3 結論

本研究采用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用技術分析酵母L-EL、CRI和LABA釀造龍眼果酒的香氣成分，3種釀酒酵母釀造的龍眼果酒中共檢出揮發性風味物質58種，包括酯類19種、醇類8種、醛類7種、烯類2種、酸類4種、醚類3種、酚類5種、醛酮類6種、呋喃類4種。結合ROAV計算，篩選出由L-EL酵母釀造的龍眼果酒中關鍵香氣成分（ROAV≥1）有3種；由CRI酵母釀造的龍眼果酒中關鍵香氣成分（ROAV≥1）有7種；由LABA酵母釀造的龍眼果酒中關鍵香氣成分（ROAV≥1）有6種，其中，辛酸乙酯在3種龍眼果酒中對總體風味的貢獻度最大。綜合考慮，CRI酵母發酵果酒揮發性風味物質的種類最為豐富，其酯類物質含量最高，更適合釀造龍眼果酒。