微小RNA-1246在結直腸癌患者血清中的表達水平及其臨床意義

劉麗萍,崔發財

1.河南省新密市中醫院檢驗科,河南新密 452300;2.河南省人民醫院檢驗科,河南鄭州 453000

結直腸癌(CRC)是一種常見的消化道惡性腫瘤,國際癌癥研究機構的數據顯示2020年全球新發CRC病例數約為185萬[1],新增病死病例數約為90萬,其發病率和病死率已分別位列全球惡性腫瘤的第三位和第二位[2],嚴重影響患者的生命健康。局限性發病的CRC患者5年生存率可達90%以上[3],而TNM Ⅳ期CRC患者5年生存率僅為10%左右[4],轉移和復發是導致CRC患者死亡的主要原因[5],因此篩選潛在的CRC生物標志物用于腫瘤的早期診斷和轉移預警,對于改善患者預后和提高術后生存率至關重要。微小RNA(miRNA)是一類長度為20～22 nt的內源性非編碼RNA,在生理條件下參與細胞分化、細胞間信號傳導等多個細胞生物學過程[6]。有研究報道miRNA異常表達參與腫瘤的發生、發展過程[7],其中一些miRNA可穩定表達于腫瘤患者體液中被稱為循環miRNA,它們具有腫瘤異質性、組織特異性、含量豐富和易于檢測等優點[8],為臨床CRC篩查提供了新的手段。miR-1246是一種新發現的miRNA,有研究發現其在乳腺癌[9]、多發性骨髓瘤[10]及宮頸癌[11]患者血清中表達水平升高,在腫瘤早期診斷和預后評估方面均發揮重要作用,miR-1246在CRC組織中高表達并與TNM分期和淋巴結轉移相關[12],但其在CRC患者血清中的表達情況鮮見報道。本研究將分析miR-1246在CRC患者血清中的表達情況,分析其與患者臨床病例特征的關系,并進一步評價其在CRC診斷方面的價值?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2020年12月在新密市中醫院接受手術治療的60例CRC患者作為CRC組,另選取同時期在本院住院治療的60例結直腸腺瘤(CRA)患者作為CRA組和60例健康體檢者作為健康對照組。納入標準：(1)CRC經術后病理檢查確診,并符合《中國結直腸癌診療規范(2017版)主要更新概要》[13]中的相關診斷標準;(2)患者術前未接受放化療及免疫治療;(3)臨床資料完整。排除標準：(1)合并炎癥性腸病或克羅恩病或腺瘤性息肉病;(2)合并重要臟器器質性病變及功能不全;(3)患有其他類型惡性腫瘤疾病或癌前病變。CRC組男39例,女21例;平均年齡(51.3±8.8)歲;低分化腺癌19例,中、高分化腺癌41例;參考美國癌癥聯合委員會(AJCC)直腸癌TNM分期標準[14]： Ⅰ期6例,Ⅱ期22例,Ⅲ期16例,Ⅳ期16例;淋巴結轉移33例,無淋巴結轉移27例。CRA組男35例,女25例;平均年齡(48.7±6.5)歲。健康對照組男36例,女24例;平均年齡(47.2±9.3)歲。三組性別、年齡比較,差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性。所有研究對象均知曉本研究,并簽署知情同意書;本研究經新密市中醫院醫學倫理委員會批準(編號：XMSZYY-20220201001)。

1.2儀器與試劑 用于檢測miR-1246表達的RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒和高特異性染料法定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測試劑盒均購自諾唯贊生物科技有限公司,miR-1246引物由上海生工生物工程公司合成,UV-3600紫外分光光度計購自日本島津公司,ABI 7500實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司;用于檢測癌胚抗原(CEA)、糖類抗原(CA)199水平的試劑盒及配套質控品,Abbott i2000電化學發光免疫分析儀均購自美國雅培公司。

1.3方法

1.3.1標本采集與處理 分別抽取3組研究對象清晨空腹靜脈血于真空采血管(5 mL促凝管,13 mm×75 mm,三力醫療),室溫靜置30 min,離心(離心速度3 000 r/min、離心半徑8 cm)5 min后,收集1.0～1.2 mL血清于1.5 mL無RNA酶EP管中,凍存于-80 ℃超低溫冰箱中待測,標本避免反復凍融。

1.3.2血清miR-1246表達水平檢測 采用TRIzol法提取血清總RNA,采用紫外分光光度法測定RNA的水平和純度。將總RNA加入含反轉錄酶的反應體系中合成cDNA。制備qPCR擴增體系：正、反向引物各0.4 μL,cDNA 2 μL,2 ×SYBR Green qPCR預混合試劑10 μL,加雙重去離子水補足至20 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min,95 ℃變性15 s,61 ℃退火30 s,70 ℃ 延伸20 s,40個循環。采用2-ΔΔCt法計算血清中miR-1246相對表達水平。miR-1246正向序列：5′-ACACTCCAGCTGGGAATGGATTTTTGG-3′,反向序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′; U6正向序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.3血清CEA和CA199水平檢測 采用電化學發光免疫分析法檢測血清CEA和CA199水平,電化學發光免疫分析儀開機后首先進行室內質控測量,當CEA和CA199的質控數據在控后,按照試劑盒說明書檢測血清CEA和CA199水平。

1.4統計學處理 采用SPSS21.0和Graphpad Prism7.0軟件進行統計學分析和繪圖。計量資料首先進行Kolmogorov-Smirnov(K-S)正態性檢驗,呈偏態分布的計量資料以M(P25,P75)表示,多組間比較采用采用Kruskal-WallisH檢驗,兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。采用Spearman相關分析CRC患者血清miR-1246表達水平與血清CEA、CA199水平的相關性。繪制受試者工作特征(ROC)曲線評估血清miR-1246聯合CEA、CA199診斷CRC的價值。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1三組研究對象血清miR-1246、CEA和CA199水平的比較 CRC組血清miR-1246表達水平顯著高于CRA組和健康對照組(P<0.05),而CRA組和健康對照組血清miR-1246表達水平比較,差異無統計學意義(P>0.05);CRC組血清CEA、CA199水平顯著高于CRA組和健康對照組(P<0.05),而CRA組和健康對照組血清CEA、CA199水平比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 三組研究對象血清miR-1246、CEA和CA199水平的比較[M(P25,P75)]

2.2不同臨床特征CRC患者中血清miR-1246、CEA和CA199水平比較 TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移和有遠處轉移CRC患者的血清miR-1246表達水平顯著高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移和無遠處轉移CRC患者(P<0.05);TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化和有遠處轉移CRC患者的血清CEA濃度顯著高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、高中分化和無遠處轉移CRC患者(P<0.05);TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有淋巴結轉移和有遠處轉移CRC患者的血清CA199濃度顯著高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、高中分化、無淋巴結轉移和無遠處轉移CRC患者(P<0.05)。見表2。

表2 不同臨床病理特征CRC患者血清miR-1246、CEA、CA199水平比較[M(P25,P75)]

2.3血清miR-1246表達水平與血清CEA、CA199水平的相關性 Spearman相關性分析結果顯示,CRC患者血清miR-1246表達水平與CEA、CA199水平均呈正相關(r=0.397,P=0.002;r=0.443,P<0.05)。見表3。

表3 血清miR-1246、CEA、CA199單項及聯合檢測對CRC的診斷價值分析

2.4血清miR-1246、CEA、CA199單項及聯合檢測對CRC的診斷價值 以CRA患者和健康對照組為陰性樣本,CRC患者為陽性樣本,繪制ROC曲線。結果顯示,miR-1246單獨診斷CRC的曲線下面積(AUC)為0.814(95%CI：0.747～0.881),顯著高于CEA[0.708(95%CI：0.619～0.796)]和CA199[0.695(95%CI：0.600～0.789)]單獨診斷的AUC(Z=2.004,P=0.045;Z=2.077,P=0.038);miR-1246聯合CEA或CA199診斷CRC的AUC分別為0.845(95%CI：0.786～0.904)和0.854(95%CI：0.795～0.913),與miR-1246單獨診斷CRC的AUC比較,差異均無統計學意義(Z=1.459,P=0.145;Z=1.725,P=0.095);miR-1246、CEA和CA199聯合診斷CRC的AUC為0.873(95%CI：0.820～0.927),顯著高于miR-1246單獨診斷的AUC(Z=2.169,P=0.030)。見圖1、表3。

圖1 血清miR-1290、CEA、CA199單項及聯合檢測診斷CRC的ROC曲線

3 討 論

CRC早期發病隱匿,多數患者出現明顯臨床癥狀才選擇就診,此時癌細胞已發生周圍組織浸潤和遠距離器官轉移,臨床治療難度大,CRC患者預后生存率差。血清CEA和CA199是臨床常用腫瘤標志物,在CRC的診斷和療效檢測方面發揮一定作用[15],但由于它們缺乏較高的靈敏度和特異度[16],常常造成部分患者漏診或誤診,臨床應用價值受到限制。

循環miRNA是腫瘤診斷標志物的熱門研究領域,它們具有腫瘤異質性、可復制和易于檢測的優點,目前已發現多個miRNA在CRC患者血清中表達水平升高,與腫瘤的臨床病理特征及預后密切相關,可能是潛在的CRC生物標志物。BADER等[17]發現,miR-223在CRC患者組織和血清中的表達具有相關性,均異常高表達,血清miR-223可作為評估CRC患者預后的特異性指標。ABO-ELELA等[18]的研究表明,CRC患者血清中miR-574-3p和miR-27a表達升高,它們在不同分期、不同分級及不同腫瘤大小患者中的表達存在顯著差異,且miR-574-3p和miR-27a聯合檢測診斷CRC的靈敏度均優于CEA和CA199單獨檢測。

CHUMA等[19]研究發現,miR-1246是一種新報道的miRNA,其在肝癌患者血清中高表達,并與淋巴結轉移、腫瘤分化和門靜脈侵襲呈正相關,血清miR-1246表達是預測肝癌患者預后的獨立影響因素; miR-1246在乳腺癌患者血清中高表達并與分期相關,其鑒別乳腺癌患者和健康志愿者的靈敏度和特異度均達到90%。本研究結果發現,血清miR-1246在CRC組患者血清中的表達水平顯著高于CRA組和健康對照組,提示miR-1246檢測可用于腸道惡性疾病的診斷,ROC曲線分析進一步顯示,血清miR-1246單獨診斷CRC的AUC為0.814(95%CI：0.747～0.881),顯著高于傳統腫瘤標志物CEA[0.708(95%CI：0.619～0.796)]和CA199[0.695(95%CI：0.600～0.789)],其性能評價處于良好區間,診斷靈敏度和特異度分別為70.2%和81.7%,對于CRC診斷具有一定價值。近年來,基于CEA和CA199的多指標聯合檢測越來越受到研究者關注,它可以彌補單指標檢測特異度或靈敏度低的缺點,可有效提高CRC患者檢出率[21]。本研究結果表明,miR-1246與CEA或CA199組成的雙指標聯合檢測未能顯著提高miR-1246對CRC的診斷效能,而miR-1246、CEA、CA199 3項聯合檢測診斷CRC的AUC為0.873(95%CI：0.820～0.927),診斷的靈敏度和特異度也均高于miR-1246單獨檢測,提示miR-1246聯合多種傳統腫瘤標志物檢測診斷CRC有更高的準確性。本研究通過分析不同臨床病理特征的CRC患者血清miR-1246表達水平發現,TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移和有遠處轉移的患者血清miR-1246表達水平顯著高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移和無遠處轉移的患者(P<0.05),提示血清miR-1246可用于評估CRC惡性程度及預測腫瘤復發與轉移。

綜上所述,miR-1246在CRC患者血清中的表達水平明顯升高,并與患者TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移有關,miR-1246對CRC的診斷效能優于CEA、CA199,而miR-1246、CEA、CA199 3項聯合檢測可進一步提高對CRC的診斷效能。然而,本次研究納入的樣本量有限,所得結論有待大樣本、長期隨訪及多中心研究證實。