中性粒細胞外誘捕網、纖溶酶原激活抑制劑1對早產急性呼吸窘迫綜合征患兒預后的影響

張 敏 楊 立

北京市通州區婦幼保健院新生兒科，北京 101100

早產兒急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是新生兒重癥監護中常見的嚴重并發癥之一，其發病率和病死率極高，主要病理特征為細胞免疫和凝血系統異常引發肺泡膜損傷、肺水腫，導致氧合功能嚴重受損，嚴重影響早產兒的生存和發育[1]。中性粒細胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）是由中性粒細胞釋放的一種特殊細胞外陷阱，由游離DNA（cell free-DNA，cf-DNA）、中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等組成[2]。當中性粒細胞受到感染或激活時，NETs 會形成并釋放，起到限制病原微生物擴散的作用。然而，過度活化的NETs 可能導致炎癥反應的過度放大和組織損傷，在多種疾病中發揮著不可忽視的作用[3]。纖溶酶原激活抑制劑1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）是一種調節凝血和纖溶平衡的重要蛋白質，其可抑制纖溶系統的活化，導致血栓形成和肺泡膜微循環障礙，與肺細胞損傷和纖維化進程相關[4]。NETs 和PAI-1 可能參與了ARDS 的發生、發展，但二者與早產兒ARDS 的研究相對缺乏。因此，本研究旨在探究早產ARDS 患兒血漿NETs、PAI-1 的水平變化與患兒預后結局的關聯，以期為臨床早產兒ARDS 的診斷、個體化治療提供新思路。

圖1 cf-DNA、PAI-1 預測早產ARDS 患兒預后不良的ROC 曲線

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2020 年1 月至2022 年12 月北京市通州區婦幼保健院收治的早產ARDS 患兒125 例作為研究對象（ARDS 組），其中男71 例，女54 例；胎齡28～36周，平均（30.69±3.17）周。納入標準：①ARDS 的診斷符合《“新生兒急性呼吸窘迫綜合征”蒙特勒標準（2017年版）》[5]相關標準；②胎齡28～37 周；③需行氣管插管有創通氣；④監護人對收集新生兒資料進行研究具有知情權。排除標準：①合并先天性血液系統疾病；②合并其他先天性呼吸系統疾病；③合并染色體異常、遺傳代謝性疾病、先天性心臟病等；④合并心、肝、腎功能嚴重損害。本研究經北京市通州區婦幼保健院倫理委員會的審批同意（2022-TZFY-010-01）。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料 收集并統計患兒的基本資料，包括性別、孕齡、Apgar 評分、出生方式、出生體重、ARDS 分級、孕婦產前激素使用情況及妊娠糖尿病情況。

1.2.2 樣本采集 采集入組對象出生1 d 內靜脈血2 ml，靜置1 h，3 500 r/min 離心8 min（離心半徑為14.5 cm），分離血漿，置于-80℃冷藏器中保存備用。

1.2.3 生化指標的檢測 常溫溶解樣本，基于PicoGreen熒光染料法，使用熒光酶標儀測定血漿cf-DNA 水平，DNA 檢測試劑盒購于美國Invitrogen 公司（貨號：UA20200100595）；雙抗體酶聯免疫吸附試驗法檢測NE、TNF-α、PAI-1 水平，NE 檢測試劑盒購于深圳晶美生物技術有限公司（貨號：SZBD20153768），TNF-α檢測試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司（貨號：SZBD20204783），PAI-1 檢測試劑盒購于上海杏宜生物科技有限公司（貨號：SZBD2018034765）。

1.2.4 患兒預后監測 收集并統計患兒預后信息，預后不良定義為患兒死亡、病情無好轉而轉院治療、有創通氣＞10 d，其余情況為預后良好。并據此進行分組。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗；計數資料用例數或百分率表示，比較采用χ2檢驗；等級資料比較采用秩和檢驗；相關性分析使用Pearson 檢驗；早產ARDS 預后不良的影響因素采用logistic 回歸分析；cf-DNA、PAI-1 對早產兒ARDS 預后不良的預測價值采用受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估，曲線下面積比較采用非參數秩和檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

125 例早產ARDS 患兒預后不良47 例，預后良好78 例。

2.1 兩組一般資料和生化指標比較

預后不良組cf-DNA、NE、TNF-α、PAI-1 水平高于預后良好組（P＜0.05）。兩組Apgar 評分、出生體重、ARDS 分級、分娩方式、產前激素使用、妊娠糖尿病比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組一般資料和臨床資料比較

2.2 早產ARDS 患兒cf-DNA 與NE、TNF-α 的相關性

早產ARDS 患兒cf-DNA 與NE、TNF-α 呈正相關（r=0.645、0.687，P＜0.001）。

2.3 早產ARDS 患兒不良預后的影響因素

以早產ARDS 患兒預后為因變量（不良=1、良好=0），cf-DNA、NE、TNF-α、PAI-1 為自變量（原值帶入）進行logistic 回歸分析。結果顯示，cf-DNA、PAI-1 水平升高是早產ARDS 患兒預后不良的危險因素（OR=2.188、2.303，P＜0.05）。見表2。

表2 早產ARDS 患兒不良預后的影響因素

2.4 cf-DNA、PAI-1 對早產ARDS 患兒預后不良的預測效能

cf-DNA、PAI-1 聯合預測早產ARDS 患兒預后不良的曲線下面積高于各指標單獨預測（Z=3.272、2.229，P=0.001、0.026）。見圖1、表3。

表3 cf-DNA、PAI-1 對早產ARDS 患兒預后不良的預測效能

3 討論

ARDS 是各種肺內外因素導致的肺組織彌漫性損傷，以頑固性低氧血癥、呼吸困難為主要臨床特征，在小胎齡、低體重的早產兒中時有發生[6]。早產兒肺炎、胎糞吸入、圍生期窒息、菌血癥等導致ARDS 的肺內外因素更易發生，加之其免疫力低下、抗外界環境能力差，患兒病情難以控制、預后極差[7]。ARDS 的主要病理機制是肺泡上皮、內皮細胞受損，引起終末微血管-肺泡屏障功能不全，體液滲入肺泡中造成肺水腫，引起肺通氣、換氣障礙，此過程與中性粒細胞過渡活化、炎癥反應過渡激活、凝血纖溶系統失衡有關[8]。cf-DNA、PAI-1 分別是中性粒細胞激活、凝血系統失衡的重要標志物，二者可能與早產兒ARDS 的發生密切相關。

當機體受病原微生物侵襲時，中性粒細胞被激活釋放出一種以DNA 為基本框架且附著大量顆粒蛋白、肽類物質的網狀纖維，即為NETs[9]。cf-DNA、NE是NETs 的主要成分，二者可較好地反映機體NETs水平[10]。NETs 的形成可以捕獲、消滅入侵的病原微生物，但過量產生的NETs 不僅直接損傷組織細胞，還可對炎癥介質和蛋白質進行招募，進而放大炎癥級聯反應，導致組織上皮細胞和內皮細胞凋亡[10-11]。此外，有研究發現，急性肺損傷發生時，NETs 可激活并誘導M0 亞型巨噬細胞向M1 型轉換，進而導致TNF-α 過度分泌加重炎癥反應，同時TNF-α 亦可促進NETs 形成，進一步加重肺組織損傷[12]。有研究發現，急性肺損傷大鼠肺泡灌洗液中NETs 形成明顯增加、肺組織炎癥反應明顯；使用DNA 降解酶干預后NETs 顯著下降，且肺組織損傷減輕[13]。提示清除NETs 有助于肺組織損傷恢復。本研究結果顯示，預后不良組cf-DNA、NE、TNF-α 水平高于預后良好組。提示患兒體內中性粒細胞高反應性、NETs 生成明顯，且隨著NETs 生成增多，患兒肺組織損害程度越明顯，病情亦越重，預后越差。本研究結果顯示，早產ARDS 患兒cf-DNA 水平與NE、TNF-α 水平呈正相關。進一步說明NETs 水平越高，其對肺組織的炎癥損傷越重。本研究結果顯示，cf-DNA 是早產ARDS 患兒預后不良的獨立危險因子。提示其與患兒預后具有較好的量化關系，也間接提示NETs 是預測早產ARDS 患兒預后不良的有效標志物之一。筆者推測，早產ARDS 患兒肺組織上皮細胞、內皮細胞損傷明顯，外界病原微生物入侵后，刺激中性粒細胞活化，進而釋放NETs 發揮滅菌作用，但在此過程中NE、TNF-α 等炎癥因子亦大量生成，進而加重肺組織細胞上皮-內皮屏障的破壞，加速肺水腫、促進ARDS 的進展，導致患兒病情加重、預后不良[10-13]。

PAI-1 屬于絲氨酸蛋白酶超家族成員之一，其可抑制鏈激酶和尿激酶的纖溶作用，抑制體內纖溶活性、增強凝血活性，進而促進纖維蛋白的形成[14-15]。ARDS 最為顯著的組織學改變為肺血管內皮細胞、上皮細胞損傷，進而導致上皮-內皮細胞屏障破壞、通透性增加，富含蛋白質的滲出液進入肺泡造成氣體交換障礙[16]。早產ARDS 患兒缺氧嚴重，并可繼發感染、酸中毒，導致血管內皮細胞和內外源凝血途徑被異常激活，患兒處于高凝狀態，纖維蛋白大量產生[17]。但是，ARDS 患兒血管內皮細胞破壞明顯，其產生的纖溶酶降低，加之炎癥反應激活巨噬細胞釋放大量PAI-1，導致體內凝血-纖溶系統平衡破壞，體內大量的纖維蛋白不能被及時溶解、消除，進而大量沉積于肺微循環血管、肺泡內，引發血液循環障礙、肺組織血氣交換障礙，加重患兒病情[18-19]。此外，有研究證實，PAI-1 還可通過NF-κB 信號通路誘導小鼠肺組織炎癥反應，進而加重小鼠肺纖維化程度[20]。本研究結果顯示，預后不良組PAI-1 水平高于預后良好組，且可對患兒不良預后進行獨立預測。提示PAI-1 可反映早產ARDS患兒病情及預測患兒預后，原因在于早產ARDS 患兒體內處于高凝狀態，纖維蛋白大量形成，PAI-1 的異常釋放抑制鏈激酶和尿激酶的纖維蛋白溶解作用，導致機體纖溶活性降低、凝血活性增高，最終導致大量纖維蛋白沉積于肺泡中而形成透明膜，加重患兒病情、引發患兒預后不良[21-25]。

本研究結果顯示，cf-DNA 和PAI-1 對早產預測效能ARDS 患兒不良預后具有較好的預測效能，且二者聯合進一步提升預測效能，進一步證實二者可指導臨床及早評估早產ARDS 患兒病情，預測不良預后，并可據此及時制訂有效干預措施。

綜上所述，cf-DNA、PAI-1 水平升高是早產兒ARDS 患兒預后不良的危險因素，二者聯合檢測對患兒的預后具有較高的預測效能，二者有望成為評估患兒病情及預后的可靠指標。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。