基于軟光刻的高分子生物材料表面圖案化及改性研究進展

管 馨 翁鑫澤 賴穎真 鄭曉丹

廈門醫學院口腔醫學系 口腔生物材料福建省高校工程研究中心，福建廈門 361023

生物材料表面的微形貌可以通過簡單地模仿細胞內的地形線索，從而影響細胞的黏附、增殖、分化，最終影響缺損組織的修復[1]。如溝槽、條紋等各向異性圖案可使細胞骨架改變，在微納米尺度上與形貌方向對齊，形成“接觸誘導”效應。而坑、樁等隨機或均勻分布的各向同性圖案能夠在微米尺度上影響細胞群體化行為，諸如細胞黏附程度、鋪展面積、信號傳導等[2]。生物材料表面圖案化改性應用廣泛，通過調節細胞-材料相互作用，以圖案化表面“接觸誘導”促進細胞純化[3]；以表面微形貌促使細胞取向排列，如通過條紋狀表面實現肌細胞定向生長[4]；以微納米結構的比表面積不同影響培養液中蛋白沉積，影響細胞初始黏附[5]；通過表面物理線索，促使細胞骨架產生應力，引起細胞核形態改變及隨后的基因表達和功能的改變[6]。

隨著微加工技術的發展，可以通過光刻技術、軟刻蝕技術等在不同基材表面實現圖案化。Whiteside GM 提出一套新的軟光刻圖形技術，該方法使用1 個彈性印章作為中間模板，將圖案轉移到目標材料，其中最常用于制備彈性印章的材料是聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）[7]。現基于軟光刻技術中的PDMS 彈性印章，對如何實現生物材料表面圖案化作一總結。

1 熱塑性生物材料表面圖案化

熱塑性材料具有加熱軟化、冷卻硬化的特點，根據基本化學結構可分為聚酯、聚烯烴、聚醚、聚酰胺等種類。其中在組織工程較為關注的有聚己內酯（polycaprolactone，PCL）、聚乳酸（polylactic acid，PLA）等聚酯類，聚烯烴類（聚乙烯醇）及聚芳香醚類（聚醚醚酮）等。

對于熱塑性生物材料的表面圖案化可采用熔融澆鑄法。例如PCL，以二氯甲烷為溶劑將PCL 顆粒制備成PCL 膜，置于PDMS 表面，在真空條件下，70 ℃加熱4 h，取出，待其冷卻凝固后剝離，即得到圖案化PCL 膜。研究顯示，類骨單位同心圓微溝槽結構能夠促進干細胞成骨且顯著抑制RAW264.7 細胞的破骨分化[8]。Barata 等[9]在150 ℃下，將PDMS 模具置于PLA 膜上，熱壓印15 min，將雙光子聚合結構復制到PLA 中，冷卻脫模即得到圖案化PLA 膜，同時發現微結構的尺寸對細胞骨架和細胞核有明顯影響。

除單一材料表面圖案化外，還可嘗試利用多種材料進行圖案化。潘崇雙[10]用三氯甲烷溶解PLA、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）制備PLA/PEG 共混膜，發現PEG 的加入使復合材料的親水性得到改善，韌性更高。在此基礎上，是否可以將PLA/PEG 置于PDMS 模板上熔融澆鑄，得到物理、機械性能改良的圖案化復合膜，有待進一步嘗試。

2 熱塑性生物材料表面改性的方法

熱塑性材料具有良好的可降解性，機械強度高，易于加工；但其缺乏細胞識別位點，親水性不良，不利于細胞的黏附生長，需要再次表面改性[11]。現對表面改性的方法作一概括總結，為在不影響材料表面形貌的基礎上提供改性思路。

2.1 表面化學修飾

有學者水解處理PCL 膜增加其親水性，在此基礎上還可二次修飾[12]。朱旸[13]在PCL 膜胺解處理后接枝阿侖膦酸鈉，所接枝的阿侖膦酸鈉對干細胞有明顯的促成骨分化作用，上述實驗中薄膜表面形貌未產生顯著變化。另一項實驗采用γ-射線輻照，所接枝的聚丙烯酸鏈將銀納米離子負載到PLA 膜表面，低銀含量的PLA 薄膜表現出優異的親水性和抗菌活性[14]。

2.2 表面納米級形貌修飾

采用物理或化學手段在微米級拓撲結構的表面修飾納米級形貌，以達到微納米雙重結構對細胞生物學行為的調控。Zamani 等[15]將PCL 支架浸泡于氫氧化鈉中，發現支架形貌由光滑變為蜂窩狀，其中氫氧化鈉處理24 h 可同時促進細胞增殖和基質沉積。Park 等[16]使用氧等離子體處理PCL 支架表面，發現支架表面被精細刻蝕、粗糙度增加，促進人牙髓干細胞成骨分化。未來研究可利用堿、等離子等處理，嘗試在微米級結構上修飾規則或不規則納米級形貌，從而實現對細胞行為的雙重調控。

2.3 表面生物涂層修飾

使用涂覆、浸泡等方法在材料表面修飾膠原、殼聚糖（chitosan，CS）等高分子材料或添加細胞因子、分泌物等生物活性物質，進一步提高材料性能。Zhao 等[17]在PCL 膜氧等離子活化處理后置于胎牛血清中浸泡以提供蛋白來源，表面共價交聯水凝膠賦予高度細胞相容性。Park 等[18]在支架材料浸泡聚多巴胺后以生物礦化引入羥基磷灰石顆粒層，使骨組織有效再生。趙金龍等[19]通過浸泡將血小板衍生生長因子-BB 引入支架材料中，發現隨著血小板衍生生長因子-BB 溶液質量濃度增加，干細胞成血管相關基因表達增高。

3 非熱塑性或熔點較高的生物材料表面圖案化

對于非熱塑性或熔點較高的生物材料的表面圖案化可采用溶液澆注法，常用于生物組織工程的有CS、瓊脂糖（agarose，AG）、水凝膠、膠原、絲素蛋白（silk fibroin，SF）等。

CS 加熱到一定溫度后會直接分解，用乙酸為溶劑配制成CS 溶液，傾倒于PDMS 模板上，揮發溶劑干燥，即得到圖案化CS 膜，發現溝槽的寬深比顯著影響干細胞的“架橋”行為[20]。瓊脂糖含有多個羥基，親水性強，只溶解于熱水和有機溶劑，當溫度在35～45 ℃時會形成良好的半凝固體狀凝膠[21]。基于此特性，90 ℃水浴加熱配制AG 溶液，迅速澆注在PDMS 基底上，冷卻揭下得到圖案化AG 凝膠，此外還可將AG 作為影印圖案的印章以制備礦化鈣磷納米顆粒微圖案化的人工仿生骨膜，促進干細胞成骨分化[22]。水凝膠可以模擬水含量、機械性能和纖維網絡等人體自然組織的屬性。Jayasinghe 等[23]使用乙二醇和水配制水凝膠混合溶液，隨后傾倒在PDMS 模具上，使用Dymax 光固化系統365nm 紫外光固化90s，在磷酸鹽緩沖液中脫模，微柱陣列圖案可以增加細胞的附著。膠原為哺乳動物組織中含量最多的一類蛋白，具有良好的生物相容性和可降解性，交聯改性增強力學強度，被廣泛用于生物組織工程。熊思佳[24]在膠原溶液交聯固化后，去除氣泡澆注于PDMS 模板表面，自然風干得到微溝槽膠原膜，微溝槽結構誘導角膜上皮細胞定向排列及遷移，加快傷口愈合。SF 為蠶絲的主要成分，具有獨特的力學性能，采用水解的方法制備出不同形式的產物，如SF 膜、SF 凝膠、SF 支架等[25]。有學者在PDMS 模板表面，將SF 溶液以滴加或涂抹形式制成薄膜，再經乙醇或水蒸氣處理，穩定SF 膜[26-27]。識別表面形貌的偽足轉變對引導細胞鋪展和遷移起關鍵作用；除圖案化外，其他表面屬性在維持內皮細胞的功能中也發揮重要作用。

非熱塑性材料雖具有良好的生物相容性，但單一的成分往往難以滿足生物組織工程的需求，制備出具有多重功效的復合圖案化生物材料尤為關鍵。SF 適合作為角膜支架的生物材料，大量學者對SF 薄膜支架進行了修飾，如制備β-胡蘿卜素/SF 復合膜，溶血磷脂酸/SF 復合膜，甘油（glycerol，Gly）/SF 復合膜，PEG400/Gly/SF/薄膜[28-31]；根據混入材料的特性賦予單一成分之外更多功能，如促進細胞功能表達，增加材料彈性和熱穩定性等。此外，Lü 等[32]通過旋涂法在玻片上制備膠原/CS 薄膜，復合膜表現出更優異的親水性，提高細胞存活率。Ding 等[33]通過加入二醛化聚乙二醇及調整pH 值，將混合溶液轉化為水凝膠，開發出用于傷口敷料的自愈性CS-膠原蛋白復合水凝膠。Qian 等[34]制備的富血小板血漿/CS/SF 復合水凝膠，克服了傳統富血小板血漿凝膠降解過快的不足，并且保持生物活性分子的可持續釋放。Nogueira 等[35]使用水解膠原蛋白、CS、含有磷酸和氯化鉀的水溶液、Gly 及納米羥基磷灰石顆粒，制得共混膜。礦物的存在改善了膜的機械性能、增加表面自由能。Ahmadi 等[36]將明膠、透明質酸溶解混合，并添加載阿托伐他汀的納米結構脂質載體到溶液中，轉移到模具后真空干燥，得到復合納米薄膜，最后通過旋涂儀在膜的表面涂覆一層薄薄的PCL，PCL 賦予材料的機械性能，明膠和透明質酸提供良好的生物學功能。

上述復合膜的制備簡要概括為將所需材料以溶液形式混合，然后澆注于平面上，經過干燥等處理后得到復合膜。那么是否可以在最后一步將溶液澆注于PDMS 基底上，制備出圖案化復合膜。但溶劑的揮發是否造成薄膜皺縮、材料之間的物理化學反應等是否對材料表面微形貌的精細復刻產生影響，有待進一步嘗試改進研究。

4 總結與展望

生物材料表面圖案化的方法大致分為兩種，熱塑性材料采用熔融澆鑄法，將材料以膜狀置于PDMS 基底上，加熱融化待冷卻凝固后即得到圖案化材料；非熱塑性或熔點較高的材料采用溶液澆注法，將材料以液態澆注于PDMS 基底上，干燥后剝離即可。由于生物材料單一的理化特點難以滿足生物組織工程的需求，熱塑性與非熱塑性材料均可嘗試多種成分疊加的復合材料，同時可以借鑒熱塑性生物材料表面改性的方法制備具有多重功效的圖案化材料。此外，熱塑性材料具有優異的機械性能，但其親水性較差；非熱塑性材料具有良好的生物相容性，但其抗壓強度和硬度過低。將兩種材料進行互補提高綜合性能，可以成為未來進一步的改性方向。本文為組織工程開發出既保留原有圖案化結構又具有新功能特性的材料提供依據。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。