基于孟德爾隨機化研究的先兆子癇與缺血性卒中的關聯性分析

王 洋 奚 志 王 銘 修佳琦 李 冰 楊霄鵬

鄭州大學第二附屬醫院神經內科，河南鄭州 450003

先兆子癇是一種嚴重的妊娠期高血壓疾病，通常在懷孕20 周后表現為血壓升高和蛋白尿等主要癥狀，是導致孕產婦死亡率和發病率升高的原因[1-2]。全球范圍內，卒中是主要的死亡和殘疾原因之一，其中缺血性卒中占卒中總數的63%左右，給全世界帶來了巨大的疾病負擔[3]。多項研究表明，先兆子癇增加了孕產婦患心血管疾病、糖尿病和卒中的風險[4-6]，這些風險可能在分娩后數月至數年內出現[7]。因此研究這2 種疾病之間的聯系對于預防長期卒中風險具有重要意義。但這些研究大多是觀察性的，不能建立因果關系，因為可能存在混雜因素和反向因果關系的干擾。孟德爾隨機化（Mendelian randomization，MR）是一種流行病學研究方法，利用與暴露密切相關并滿足特定假設的遺傳變異作為工具變量[8-9]。由于這些工具變量在減數分裂時隨機分配，MR 可以模擬隨機對照試驗，最大限度地減少混雜，并且不受外部干擾的影響，因此可提供更可靠的因果關系分析[10-11]。本研究利用大規模的全基因組關聯研究（genome-wide association study，GWAS）數據集，采用兩樣本MR 方法，進一步探討先兆子癇與缺血性卒中及其亞型之間的因果關系。

1 資料與方法

1.1 資料來源

先兆子癇的匯總數據集來自FinnGen 聯盟，其中包括3 903 例病例和114 753 例對照。研究的結局均來自于MEGASTROKE 聯盟，并且根據Org 10172 試驗在急性卒中治療分類中進行定義，即缺血性卒中（34 217 例病例和406 111 例對照）及其3 種亞型，其中包括大動脈卒中（4 373 例病例和146 392 例對照）、小血管卒中（5 386 例病例和192 662 例對照）和心源性卒中（7 193 例病例和204 570例對照）[12-13]。

1.2 研究方法

1.2.1 研究設計 根據STROBE-MR 指南[14]，對先兆子癇和缺血性卒中與其亞型進行了兩樣本MR 分析，用作工具變量（instrumental variable，IV）的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）必須遵循3個重要假設[15]。假設1 是工具變量與先兆子癇強相關。假設2 是工具變量獨立于任何潛在的混雜因素。假設3 是工具變量僅通過先兆子癇影響缺血性卒中及其亞型。見圖1。

圖1 研究流程

1.2.2 工具變量選擇 確定全基因組顯著性閾值：首先，確定全基因組顯著性閾值為P＜5×10-6，以確保選擇具有統計學意義的基因型[16]。設定連鎖不平衡參數閾值：將去連鎖不平衡參數閾值設為r2＜0.001，同時限定遺傳距離為10 000 kb，以保證所選工具變量的獨立性。使用F 統計量評估工具變量：計算F 統計量來評估工具變量的弱工具變量偏倚[17]。F 統計量的計算公式為F=β2/S.E.2，其中β 表示對先兆子癇的估計遺傳效應，S.E.表示遺傳效應的標準誤差。選擇F統計量＞10 的工具變量，以確保工具變量具有足夠的預測能力。進行SNP 的隨機化處理：在選擇工具變量之后，通過隨機化方法去除模糊和回文的SNP，確保所選SNP 的準確性和一致性。檢查結局數據中的P值：匯總檢查結局數據中的P 值，剔除與缺血性卒中及其亞型高度相關的SNP，閾值設定為P＞5×10-6。確保所選SNP 與結局變量無關，確保工具變量的排他性。

1.2.3 MR 分析 采用逆方差加權法（inverse-variance weighted，IVW）作為主要的分析方法，并使用加權中位數法（weighted median，WM）和MR-Egger 截距法進一步證明結果的穩定性。

1.2.4 敏感性分析 用IVW 的Cochran Q 統計量檢驗異質性，P＜0.05 提示GWAS 數據中的遺傳工具變量存在異質性，采用IVW 隨機效應模型分析關聯；反之，則采用IVW 固定效應模型[18]。應用MR-Egger 截距法和MR-PRESSO 方法測試多效性，如果P＜0.05 則提示結果具有顯著的多效性[19]。此外，使用留一法分析測試結果的穩健性。留一法通過依次消除每個SNP分析計算剩余SNP 的結果，并與MR 分析的總效應大小進行比較，以評估結果是否受到某些SNP 的顯著影響[20]。Bonferroni 校正通過對P 值的臨界值進行校正，消除了所有假陽性結果出現的可能性。而P 值為0.0125～0.0500 被視為具有潛在的因果關系；P＜0.0125 被視為具有顯著的因果關系。

1.3 統計學方法

采用R 4.1.2 軟件“TwoSampleMR”包和“MRPRESSO”包進行數據分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

7 個與先兆子癇相關的SNP 被選擇作為遺傳工具變量，其F 統計量為21.21～25.08，均滿足F＞10的閾值，表明弱工具變量偏倚不太可能存在。在IVW 方法中，沒有證據證明先兆子癇與缺血性卒中的發病率增加相關（OR=1.05；95%CI：0.96～1.15，P=0.312）。在對缺血性卒中亞型的分析中發現，基因預測的先兆子癇可增加小血管卒中的患病風險（OR=1.21，95%CI：1.05～1.40，P=0.008），并且在MR-Egger 回歸和加權中位數法中可觀察到相同的效應大小方向，經過Bonferroni 校正之后，因果關系仍然顯著。然而未發現先兆子癇與大動脈卒中（OR=1.12，95%CI：0.89～1.40，P=0.326）和心源性卒中（OR=1.01，95%CI：0.86～1.20，P=0.857）之間存在因果關系（圖2～3）。在敏感性分析中，當探究先兆子癇與缺血性卒中及大動脈卒中的因果效應時異質性檢驗的P＜0.05，因此采用IVW 隨機效應模型進行關聯效應估計。MR-PRESSO檢驗未發現異常離群值的存在。MR-Egger 回歸法也未發現水平多效性（圖2）。留一法未發現對效應估計值影響較大的SNP，再次表明結果的穩定（圖4）。

圖2 先兆子癇與缺血性卒中及其亞型因果關系分析及敏感性分析結果森林圖

圖3 孟德爾隨機化分析散點圖

圖4 孟德爾隨機化分析“留-法”示意圖

3 討論

本研究發現遺傳預測的先兆子癇與缺血性卒中（僅限于小血管卒中）之間存在因果關系。根據Chuang 等[6]的一項大型隊列研究，患有先兆子癇的女性的卒中發病率更高。在整個隨訪期間，與對照組比較，先兆子癇患者的缺血性卒中的風險顯著增加（P＜0.001），并且于分娩后1～3 年內達到峰值。這項研究顯示這2 個特征之間具有相關性，而不能提供因果關系的證據。然而最近一項MR 研究顯示沒有證據證明先兆子癇與缺血性卒中之間具有因果關系[16]。上面所提到的研究都沒有進一步探究先兆子癇對于缺血性卒中亞型的影響。本研究擴展了以前研究的不足，提示由遺傳預測的先兆子癇與缺血性卒中的因果關系僅限于小血管卒中，而非所有的缺血性卒中。經過敏感性分析證明結果是穩健的。

先兆子癇對于缺血性卒中及其亞型的潛在的作用機制在很大程度上仍然是不清楚的，但已有研究提供了一些可能的解釋。一是血腦屏障的破壞，由于先兆子癇本質上屬于一種妊娠期高血壓疾病，血壓的急劇升高，導致壓力迅速傳遞至脆弱的大腦微血管，導致血腦屏通透性增加[21]。而血腦屏障的破壞可導致血管內的液體和血漿成分外滲，從而引起腦實質局部損傷（例如腔隙性腦梗死或皮質下小梗死）[22-23]。二是腦血流自動調節紊亂，先兆子癇患者通常伴有動態腦自動調節功能受損，同時由于血管重塑或損傷加劇血管腔擴張和狹窄，腦血流灌注不足程度加重，隨后局部腦實質缺氧和缺血導致缺血性卒中的發生[24-28]。三是炎癥因子的多重作用，先兆子癇被認為是一種炎癥性疾病，患有先兆子癇的女性循環促炎因子水平升高[29-30]。一項MR 分析研究也支持中性粒細胞計數與腔隙性卒中和小血管卒中風險增加之間存在因果關聯[31]。一方面促炎因子與血腦屏障損害彼此相互作用，一些研究表明血腦屏障的損傷先于炎癥，使血漿蛋白和免疫細胞能夠進腦實質導致不良腦血管事件的發生，同時可起到放大神經炎癥的作用；而另一些研究顯示，炎癥會進一步加重血腦屏障損害的程度[32-33]。另一方面多重炎癥因子可引起內皮功能障礙，誘導黏附分子和趨化因子的表達，將白細胞募集到腦實質中，從而促進血栓的形成[34]。因此，由先兆子癇所引起的腦微血管的任何結構損傷都可能導致缺血性卒中的發生，仍需要進一步研究先兆子癇與小血管卒中之間的關聯機制。

第一，本研究提示先兆子癇與缺血性卒中之間的因果關系僅限于特定亞型，其效應大小不容易受到反向因果關系與一些未知混雜因素的影響。第二臨床公共衛生預防意義重大，先兆子癇對于腦血管的損害是持續存在的，甚至會引起“二次打擊現象”，因此對于那些可能會出現先兆子癇的高危人群仍然應該長期服用抗血小板藥物進行預防，以防止不良腦血管事件的發生[30，35-36]。然而，該研究仍有一些局限性。首先，這些用于推斷先兆子癇和缺血性卒中之間因果關系的數據主要來自歐洲血統，因此后續需要更多的研究以確定該因果關系在其他地區和種族中是否一致。其次，本研究無法進行年齡和性別的分層分析。現有的GWAS 數據集在這2 個方面存在限制，無法提供足夠的信息來進行深入的分層分析。因此，后續可考慮采集更為詳盡信息的個體特征以便支持更精細地分層分析。

總之，本研究探索了先兆子癇與缺血性卒中及其亞型之間的因果關系，提示先兆子癇對小血管卒中的發病風險升高具有一定作用，對曾有先兆子癇病史的患者進行早期干預以降低缺血性卒中的發生具有重要的臨床指導意義。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。