蔥白提取物通過PPARγ/HO-1途徑對動脈粥樣硬化大鼠血脂異常和炎癥反應的調節作用

范鴻儒,王 棟,張 帆,楊 力,易春峰,賀立群

湖北省武漢市第一醫院/武漢市中西醫結合醫院心血管內科,湖北武漢 430022

動脈粥樣硬化(AS)是眾多心血管疾病的病理基礎,表現為慢性血管炎癥性疾病,其過程涉及動脈內壁巨噬細胞富集脂質,血管平滑肌細胞與纖維基質增生,導致內膜局部不對稱增厚,終形成阻礙血流的斑塊。這些斑塊的形成與破裂可能引起血管狹窄、器官缺血乃至梗死,并可能觸發血栓生成[1-2]。目前,AS的治療主要依靠他汀類藥物、抗血栓藥物和手術干預,但是藥物不良反應和手術并發癥的存在使得AS的臨床治療效果達不到預期[3]。因此,發掘新的治療方法對于改善AS患者的預后至關重要。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)是一類核受體,調控糖脂代謝和炎癥反應,對抗AS的發展發揮著重要作用[4]。血紅素氧合酶1(HO-1)是一種抗氧化應激酶,也是PPARγ的下游效應之一,其上調可保護血管免受氧化損傷,減少動脈粥樣硬化斑塊的形成[5]。蔥白提取物(FOB)含有豐富的活性成分,已知具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集等多種生物活性[6-8],提示了它在心血管疾病中潛在的治療價值。相關研究報道,FOB具有抗AS的作用[9],但FOB干預AS的作用機制尚未完全明確。鑒于FOB在抗炎和調節血脂等方面的潛力,筆者推測FOB可能通過激活PPARγ/HO-1途徑來發揮作用。因此,本研究探討FOB對AS大鼠模型血脂異常和炎癥反應的調節作用,以及PPARγ/HO-1途徑在其中的潛在機制,為開發新型AS治療策略提供理論基礎。現報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠40只,體質量180～220 g,6～8周齡,購自北京天誠醫藥科技有限公司[動物生產許可證號：SYXK(京)2021-0066]。本研究通過本院動物倫理委員會審批(批號：2022-0603)。大鼠自由飲水進食,飼養于濕度50%～60%、溫度18～24 ℃、12 h光暗交替的動物房。

1.2主要試劑與儀器 FOB(純度：98 %,規格：10 mg)購自深圳卓越生物醫藥科技公司;PPARγ抑制劑GW9662(純度：98 %,規格：10 mg)購自武漢科斯坦生物科技公司;總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)檢測試劑盒均購自上海齊源生物科技公司;白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、油紅O染色試劑盒、蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒均購自上海聯邁生物工程公司;Trizol試劑、反轉錄試劑盒和實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒均購自北京百奧萊博科技公司;兔抗PPARγ、HO-1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體以及辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG二抗均購自上海鈺博生物科技公司。

XSP-GX14C熒光顯微鏡購自上海光學儀器六廠;DT-380全自動生化分析儀購自盛世東唐江蘇生物科技公司;LD-96A多功能酶標儀購自山東萊恩德智能科技公司;YT-PCR1熒光定量PCR檢測儀購自山東云唐智能科技公司;6400 Advanced電泳儀購自深圳市凈康科技公司;KETA GL全自動凝膠成像分析系統購自北京好億科技發展公司。

1.3方法

1.3.1動物模型構建 大鼠適應環境后,參照文獻[10]的方法,給予高脂飼料持續喂養10周,喂養1周后腹腔注射60萬U/kg維生素D3溶液(注射1次),光學顯微鏡下觀察大鼠主動脈組織上有粥樣斑塊形成,血管壁和內膜明顯增厚,表明AS大鼠模型構建成功。

1.3.2動物分組及給藥 40只大鼠隨機分為對照組、模型組(AS組)、FOB組和FOB+GW9662組,每組10只。對照組大鼠給予正常飼料喂養,其余各組大鼠均建立AS模型。參考文獻[11]并結合預實驗結果確定給藥劑量,FOB組大鼠灌胃600 mg/kg的FOB溶液;FOB+GW9662組大鼠灌胃600 mg/kg的FOB溶液,并尾靜脈注射1 mg/kg的GW9662;AS組和對照組大鼠均灌胃等劑量生理鹽水。每天1次,連續給藥8周。

1.3.3標本采集 末次給藥結束后,采用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,采集大鼠腹主動脈血液,用TD5A臺式低速離心機(湖南凱達科學儀器有限公司)在4 ℃以3 500 r/m離心10 min后,收集血清,—80 ℃保存備用。麻醉處死大鼠,分離大鼠胸主動脈組織,清洗后取根部主動脈制作冷凍切片,其余主動脈組織保存于—80 ℃條件下備用。

1.3.4大鼠主動脈病理形態學評估 取大鼠主動脈冷凍切片,根據試劑盒說明書分別行油紅O染色、HE染色實驗。顯微鏡下觀察大鼠胸主動脈血管壁上脂質斑塊面積以及血管壁情況。

1.3.5大鼠血脂水平檢測 取大鼠血清,嚴格按照試劑盒說明書測定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C的水平。計算動脈粥樣硬化指數(AI),AI=(TC-HDL-C)/HDL-C。

1.3.6大鼠血清炎癥因子水平檢測 取大鼠血清,嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.3.7qRT-PCR法檢測大鼠胸主動脈組織中PPARγ和HO-1的mRNA表達水平 以Trizol試劑抽提大鼠胸主動脈組織總RNA,定量RNA濃度后,嚴格按照反轉錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒說明書操作,反轉錄合成cDNA,以GAPDH為內參,進行qRT-PCR擴增實驗。PPARγ正向引物序列：5′-ACAGACCTCAGGCAGATCGT-3′,反向引物序列：5′-GGGTGAAGGCTCATGTCTGT-3′;HO-1正向引物序列：5′-GGAACGTGTGCAGGTTGGAT-3′,反向引物序列：5′-TCTCCAGCAGTGCCATCTCT-3′;GAPDH正向引物序列：5′-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′,反向引物序列：5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′。反應程序：95 ℃ 30 s,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個循環。采用2-ΔΔCt法分析數據。

1.3.8Western blot法檢測大鼠胸主動脈組織中PPARγ和HO-1的蛋白表達水平 將大鼠胸主動脈組織用RIPA緩沖液裂解提取總蛋白質,使用BCA試劑盒對提取物中蛋白質的水平進行定量。取等量的蛋白質進行SDS-PAGE分離,轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,PVDF膜在5%脫脂奶粉中封閉2 h,然后用一級抗體PPARγ(1∶500)、HO-1(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)在4 ℃條件下孵育膜過夜,清洗膜,加入HRP標記的對應二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h,ECL試劑顯色,凝膠成像儀采集圖像,進行定量分析。

2 結 果

2.1各組大鼠胸主動脈組織病理變化及脂質沉積情況 對照組大鼠胸主動脈管壁結構清晰,內膜光滑、形態正常,無脂質沉積;AS組大鼠胸主動脈管壁明顯增厚,內皮細胞脫落結構不完整,內膜下可見大量炎癥細胞浸潤和泡沫細胞堆積,脂質斑塊形成;FOB組大鼠胸主動脈管壁增厚有所減輕,內皮細胞較為完整,內膜下存在少量炎癥細胞浸潤和泡沫樣細胞聚集,脂質斑塊變小,大鼠胸主動脈組織病理變化較AS組明顯改善;FOB+GW9662組大鼠胸主動脈組織病理變化和脂質斑塊較FOB組明顯加重。見圖1、圖2。

注：A為對照組;B為AS組;C為FOB組;D為FOB+GW9662組。

注：A為對照組;B為AS組;C為FOB組;D為FOB+GW9662組。

2.2各組大鼠血脂水平及AI比較 與對照組相比,AS組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平以及AI均顯著升高,HDL-C水平顯著降低,差異均有統計學意義(P<0.05);與AS組相比,FOB組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平以及AI均顯著降低,HDL-C水平顯著升高,差異均有統計學意義(P<0.05);與FOB組相比,FOB+GW9662組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平以及AI均顯著升高,HDL-C水平顯著降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血脂水平及AI比較

2.3各組大鼠血清炎癥因子水平比較 與對照組相比,AS組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著升高(P<0.05);與AS組相比,FOB組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著降低(P<0.05);與FOB組相比,FOB+GW9662組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較

2.4各組大鼠胸主動脈組織中PPARγ和HO-1的mRNA表達水平比較 與對照組相比,AS組大鼠胸主動脈組織中PPARγ和HO-1的mRNA表達水平均顯著降低(P<0.05);與AS組相比,FOB組大鼠胸主動脈組織中PPARγ和HO-1的mRNA表達水平均顯著升高(P<0.05);與FOB組相比,FOB+GW9662組大鼠胸主動脈組織中PPARγ和HO-1的mRNA表達水平均顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠胸主動脈組織中PPARγ和HO-1的mRNA表達水平比較

2.5各組大鼠胸主動脈組織中PPARγ和HO-1的蛋白表達水平比較 與對照組相比,AS組大鼠胸主動脈組織中PPARγ和HO-1的蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05);與AS組相比,FOB組大鼠胸主動脈組織中PPARγ和HO-1的蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05);與FOB組相比,FOB+GW9662組大鼠胸主動脈組織中PPARγ和HO-1的蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)。見圖3、表4。

表4 各組大鼠胸主動脈組織中PPARγ和HO-1的蛋白表達水平比較

圖3 各組大鼠胸主動脈組織中PPARγ和HO-1的蛋白表達電泳圖

3 討 論

AS作為一種血管炎癥疾病,在老年人中尤其普遍,對老年人生活質量產生了嚴重不良影響。目前AS治療主要集中在中晚期,以抗血小板聚集、調節脂質代謝、控制血壓和血糖等綜合治療為主[12]。然而,預防AS進展比改善疾病預后更有意義。FOB在中醫中被廣泛用于發汗解表、通陽利竅、溫中行氣和解毒消腫,臨床上常與其他藥物配伍,治療風寒感冒、鼻塞、麻疹、消化不良和瘡瘍等多種疾病,同樣也具有抗炎抗氧化的功能[13]。FOB含有多種生物活性成分,這些成分被廣泛研究,因其在抗炎中展示的潛在益處而受到關注。例如,FOB主要成分硫化物具有減少炎癥細胞浸潤的功能,可以對抗病毒引起的免疫過度激活[14]。研究表明,FOB在治療心肌缺血引起的心肌微血管內皮細胞結構形態和功能變化、心肌梗死后心肌細胞凋亡以及纖維化中均表現出潛在的益處[15-17]。亦有研究證明FOB可以抑制AS進展[18]。本研究在既往研究基礎上分析FOB抗AS的作用機制,通過建立AS大鼠模型,觀察大鼠胸主動脈組織形態學,結果顯示,AS大鼠胸主動脈管壁明顯增厚,存在炎癥細胞浸潤和脂質堆積,斑塊形成。該結果與人類AS的病理結果一致,表明AS大鼠模型建立成功。

脂質代謝異常是AS的危險因素和主要特征,血清中的膽固醇可通過受損的血管內皮滲入到動脈壁,進而在動脈內膜積聚形成脂質斑塊[19]。異常脂質譜的特征通常是血液TC、TG、LDL-C水平升高和HDL-C水平降低。馮云霞等[20]研究報道,FOB可以明顯降低高脂血癥大鼠血清TG、LDL-C水平,升高血清HDL-C水平。本研究中,與對照組相比,AS大鼠血清TC、TG、LDL-C水平以及AI均顯著升高,HDL-C水平顯著降低;FOB干預有效降低了AS大鼠血清TC、TG、LDL-C水平以及AI,有效升高了HDL-C水平。表明FOB能夠通過調控血脂水平減輕大鼠AS。炎癥存在于整個AS過程中,是AS發展的關鍵因素。白細胞(主要是巨噬細胞)的積累是AS從開始到晚期的突出特征。巨噬細胞中的脂質積累誘發炎癥,炎癥促進和增強AS的發展,炎癥和AS病變的發展形成正反饋回路。因此,抗炎治療是延緩AS斑塊發展并穩定晚期病變的有效途徑之一[21]。研究數據顯示,AS中炎癥反應表現為TNF-α、IL-1β、IL-6以及黏附分子水平異常升高[22]。本研究結果發現,與對照組相比,AS大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均明顯升高,FOB干預降低了AS大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平。提示FOB在AS中通過調控炎癥因子表達發揮抗炎作用。

PPARγ是核激素受體超家族的成員之一,該超家族被認為在各種病理條件下介導許多信號通路[23]。在被特異性配體激活后,PPARγ被易位以進一步激活PPAR應答元件以啟動靶基因轉錄,PPARγ的激活被認為對細胞凋亡和炎癥反應都有保護作用[24]。HO-1是一種應激響應蛋白,可將促氧化血紅素降解為游離鐵、膽綠素(膽紅素)和一氧化碳,HO-1通過這些酶促反應發揮其各種生物活性[25]。鷹嘴豆芽素A通過激活PPARγ/HO-1途徑抑制脂質積累和炎癥反應來預防AS[26]。夏雯等[27]報道,FOB能夠促進AS大鼠胸主動脈中PPARγ蛋白表達。本研究在此基礎上探究PPARγ/HO-1信號通路是否參與FOB抗AS過程,結果顯示,FOB干預后,AS大鼠胸主動脈組織中PPARγ和HO-1的mRNA表達水平以及PPARγ和HO-1的蛋白表達水平均升高。提示FOB干預提高了AS大鼠胸主動脈組織中PPARγ和HO-1的mRNA以及蛋白表達水平。本研究進一步應用PPARγ抑制劑GW9662發現,GW9662干預逆轉了FOB對AS大鼠胸主動脈組織中PPARγ和HO-1表達的促進作用,同時,GW9662干預減弱了FOB對AS大鼠血脂水平和炎癥反應的調控作用。上述結果表明FOB可能通過激活PPARγ/HO-1信號通路對AS發揮治療作用。

綜上所述,FOB能夠通過調節血脂異常和抑制炎癥反應緩解高脂飲食誘導的AS,其作用機制可能與激活PPARγ/HO-1信號通路有關。本研究在以往研究基礎上進一步證實FOB是治療AS的潛在候選藥物,但其具體作用劑量及潛在作用機制仍需開展大量實驗研究來明確。