血清外泌體miRNA-21、miRNA-214聯合檢測在骨質疏松癥診斷中的價值

祁彩虹,李 麗,廖 璞△

1.西南醫科大學臨床醫學院檢驗科,四川瀘州 646000;2.重慶市人民醫院檢驗科,重慶 401147

骨質疏松癥(OP)是因骨組織質量和密度減少,從而導致骨骼脆弱易碎的一種普遍存在的骨骼疾病[1]。隨著人口老齡化進程加劇,OP已成為全球流行病之一,其發病率僅次于心血管疾病和糖尿病,在慢性病中排名第3位。2018年國家衛生健康委員會發布的首個我國OP流行病學調查結果顯示,我國50歲以上人群的OP患病率為19.2%,而65歲以上人群的患病率高達32.0%[2]。據世界衛生組織預測,到2050年我國骨質疏松性骨折患者將達600萬例,相應的醫療費用將達254億美元/年[3]。我國每年有數百萬人因OP導致骨折,其中約1/5的患者因骨折并發癥而死亡,約一半的存活者會面臨不同程度的殘疾,這給家庭和社會帶來了沉重的負擔[2,4]。因此,為了提高OP患者生活質量,早期診斷必不可少。

目前,OP的診斷常通過測量骨密度并結合患者的家族史和臨床癥狀來進行綜合評估[5-6]。外泌體微小RNA(miRNA)是一類具有基因表達調控功能的小分子RNA,通過調控多種生物學過程,在靶細胞內發揮作用[7]。外泌體miRNAs可以通過調節OP患者骨細胞的增殖、分化、凋亡等過程來調控骨形成與骨吸收的平衡,從而影響骨組織的代謝和再生。研究發現,與OP相關的外泌體miRNAs在血液、尿液和骨髓液等體液中的表達水平發生了變化,表明其在OP的早期診斷、治療監測及預后判斷中可能作為潛在的生物標志物[8-9]。近年來,越來越多的研究強調了外泌體miRNAs可能成為OP的生物學標志物,在OP患者早期診斷中發揮重要作用[10-12]。本研究從OP患者的血清中提取外泌體,檢測其中miRNA-21和miRNA-214的表達水平,進一步分析二者在OP臨床診斷中的應用價值,為OP的早期診斷提供依據。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2022年1月至2023年12月重慶市人民醫院收治的OP患者為研究對象。納入標準：(1)骨密度測量結果顯示骨量減少;(2)具有特定類型的骨折史;(3)常出現骨痛、身高減少和脊柱彎曲等癥狀。排除標準：(1)可能導致OP樣表現的其他骨病,如骨腫瘤、骨髓炎等;(2)使用可能導致OP的激素類藥物;(3)合并其他可能與OP有關的疾病,如甲狀旁腺功能亢進等。共納入OP組77例,其中男35例、女42例,平均年齡(71.08±10.54)歲。另選取同期在重慶市人民醫院體檢中心體檢的81例健康者為對照組,其中男38例、女43例,平均年齡(69.96±8.77)歲。兩組性別、年齡比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。所有研究對象均知曉本研究,并簽署知情同意書。本研究獲重慶市人民醫院醫學倫理委員會批準(編號：S2020-200-01;S2021-065-01)。

1.2儀器與試劑 外泌體提取試劑盒由江蘇凱基生物技術股份有限公司提供;miRNA提取試劑盒由杭州倍沃醫學科技有限公司提供;miRNA第一鏈cDNA合成(加尾法)試劑盒由生工生物工程(上海)股份有限公司提供;BlasTaq 2×qPCR MasterMix試劑由Applied Biological Materials提供;伯樂CFX96實時熒光定量PCR儀;JEM-1200EX透射電子顯微鏡(BTEM技術)購自日本電子株式會社;PMX110納米顆粒跟蹤分析儀(NTA技術)購自德國Particle Metrix公司。

1.3方法

1.3.1血清外泌體提取及鑒定 收集所有研究對象的血清,按照試劑盒說明書操作步驟提取血清外泌體,將得到的納米級囊泡復溶在300 μL磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH值7.4)中,保存于-80 ℃環境中。所有樣品的處理和離心都在冰上進行。采用生物透射電鏡和NTA技術表征外泌體的形態和大小[8,10],采用蛋白質印跡法(WB)檢測外泌體標志物CD63的表達。

1.3.2血清外泌體miRNA-21和miRNA-214提取及檢測 按miRNA提取試劑盒說明書,從外泌體中提取miRNA,然后進行實時熒光定量反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)。用miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒進行反轉錄,得到cDNA。隨后用BlasTaq 2× qPCR MasterMix試劑對cDNA進行擴增,反應條件：95 ℃ 3 min預變性,95 ℃ 1 s變性,60 ℃ 10 s退火延伸,40個循環進行擴增,每個樣品重復3次。用2-ΔΔCt計算miRNA-21和miRNA-214的相對表達水平。

2 結 果

2.1血清外泌體的鑒定 采用BTEM和NTA技術表征OP患者血清外泌體。如圖1A和圖1B所示,外泌體的大小不一,呈現出類似圓形或橢圓形的雙層脂質膜囊泡,直徑為25～265 nm,中位粒徑為105 nm。采用WB鑒定血清外泌體特異性蛋白表達,結果顯示,血清外泌體中CD63標志蛋白呈高表達(圖1C)。

注：A為BTEM表征外泌體的形態;B為NTA技術追蹤外泌體大小;C為WB鑒別外泌體特征蛋白CD63的表達。

2.2兩組血清外泌體miRNA-21、miRNA-214表達水平比較 OP組血清外泌體miRNA-21和miRNA-214相對表達水平明顯高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組血清外泌體miRNA-21、miRNA-214表達水平比較[M(P25,P75)]

2.3miRNA-21、miRNA-214影響OP發生的Logistic回歸分析 以是否患OP為因變量(賦值：是=1,否=0),以miRNA-21、miRNA-214的相對表達水平為自變量(賦值：均為原值輸入),進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示,miRNA-21、miRNA-214相對表達水平升高是導致OP發生的危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 miRNA-21、miRNA-214影響OP發生的Logistic回歸分析

2.4血清外泌體miRNA-21、miRNA-214單獨及聯合檢測對OP的診斷效能分析 根據多因素Logistic回歸分析得到血清外泌體miRNA-21、miRNA-214聯合檢測診斷模型,即Y=-3.326+0.624×XmiRNA-21+ 0.756×XmiRNA-214。以對照組為陰性樣本,OP患者為陽性樣本,繪制ROC曲線。結果顯示,血清外泌體miRNA-21、miRNA-214聯合檢測診斷OP的靈敏度為90.9%,特異度為84.0%,AUC為0.919,高于miRNA-21、miRNA-214單獨檢測的AUC(0.853、0.811),差異均有統計學意義(Z=-3.079,P<0.05;Z=-3.518,P<0.001)。見表3、圖2。

表3 血清外泌體miRNA-21、miRNA-214單獨及聯合檢測診斷OP的效能分析

圖2 血清外泌體miRNA-21、miRNA-214單獨及聯合檢測診斷OP的ROC曲線

3 討 論

OP在全球范圍內分布廣泛,其發病率隨著人口老齡化趨勢的加劇而上升。流行病學研究表明,OP對中老年人(特別是女性)的身體健康影響較大。女性絕經期后由于雌激素水平降低,患OP的風險明顯增加[1,13]。此外,一些慢性疾病、遺傳因素、不良生活方式和營養不良也與OP的發生、發展密切相關。OP使骨骼(特別是脊椎、髖部和腕部)易發生骨折,不僅會導致疼痛和功能障礙,還可能引發殘疾等嚴重的健康問題,導致生活質量下降[2-3]。總體而言,對患者的健康和生活質量造成重大影響的OP是一個嚴重的公共衛生問題。預防、早期診斷和綜合治療是控制OP的關鍵策略,可以減少骨折風險并提高患者的生活質量[4]。

目前,OP的診斷多以影像學檢查并輔以實驗室檢查而確診,然而,實驗室診斷缺乏早期診斷指標,且特異度不高、靈敏度也較低,影像學診斷在出現結構改變時才能發現,這些改變往往不可逆,不利于患者的預后[14]。

miRNAs是一類內源性非編碼小分子(長度通常為19～25個核苷酸)單鏈RNA,廣泛存在于真核生物中,高度保守,通過與靶基因mRNA的互補序列(3′非翻譯區、5′非翻譯區、編碼區)結合,在轉錄后水平調節基因表達[15]。miRNAs參與疾病的起源和發展,并具有病理特異性,因此可作為疾病早期檢測的生物標志物[16]。

外泌體是一種細胞主動分泌的納米囊泡(直徑30～150 nm),具有脂質雙分子層結構,內含多種核苷酸(如DNA、miRNA、LncRNA等)、特異性蛋白和脂類等遺傳物質[17]。研究表明,外泌體可作為遺傳信息的傳遞者參與多種疾病的發生、發展,通過攜帶和傳遞信號分子到細胞,從而調節細胞的病理和生理狀態[17-18]。在許多生物過程中,細胞將miRNAs包裹在外泌體內,通過外泌體釋放到外周循環,從而靶向調控受體細胞中靶mRNA的翻譯。研究發現,外泌體的脂質雙分子層結構可使其包裹的物質免受RNA酶及蛋白酶等的降解[19-20]。循環miRNAs被外泌體包裹后具有高度生物學穩定性,如血漿外泌體miRNA在4 ℃儲存96 h或在-70 ℃下儲存4周后,其表達譜仍無明顯變化,且在-20 ℃以下保存5年仍能保持其數量的相對穩定,甚至在經過2次反復凍融后仍未受到明顯影響[21]。因此,除生物學特性及靶向特異性外,外泌體的膜結構可增強miRNAs的穩定性,提高其作為OP早期診斷生物標志物的能力。

研究發現,在OP的發病機制中,外泌體miRNAs發揮了重要作用。SUN等[10]研究發現,破骨細胞能夠分泌非常豐富的外泌體源性miRNAs,并驗證了其在血液循環中不僅可以作為骨量丟失的生物標志物,還可選擇性地調節成骨細胞的功能。LI等[8]研究發現,血清外泌體miR-214-3p水平升高與老年女性的骨折及去卵巢小鼠的骨形成減少密切相關,骨髓間充質干細胞成骨分化可被破骨細胞分泌的含有miR-214的外泌體囊泡抑制。MENG等[12]研究發現,miRNA-21通過靶向調控多個信號通路和基因表達,參與調節骨細胞增殖、分化和骨重建等過程,可抑制骨吸收,促進骨形成,從而對OP的發生和發展產生影響。miRNA-21和miRNA-214的異常表達可能導致骨細胞功能紊亂,破壞骨吸收與骨重建的平衡,從而導致OP的發生。說明骨組織細胞來源的外泌體miRNA-21和miRNA-214可能作為早期診斷的生物標志物,在OP的早期篩查及診療過程中蘊含巨大潛力和價值,臨床應用前景廣闊。

本研究結果表明,OP組血清外泌體miRNA-21和miRNA-214表達水平高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。除此之外,本研究還評估了miRNA-21和miRNA-214檢測在OP診斷中的應用價值,結果顯示,血清外泌體miRNA-21、miRNA-214聯合檢測診斷OP的靈敏度(90.9%)和特異度(84.0%)均較高,且二者聯合診斷OP的AUC為0.919,高于各指標單獨檢測的AUC。表明血清外泌體miRNA-21和miRNA-214聯合檢測對OP患者和健康人群的識別更準確,可提高OP早期發現率。

綜上所述,血清外泌體miRNA-21和miRNA-214表達水平升高是導致OP發生的危險因素,miRNA-21和miRNA-214單獨檢測對OP的診斷具有一定的價值,且二者聯合檢測可提高診斷的精確性。通過外泌體來源的miRNAs診斷OP,具有準確、快捷和無創等特點。但本研究樣本量較少,可能會造成某種程度上研究結果的偏倚,因此存在一定的局限性。在本研究基礎上,未來需要加大樣本量,并開展多中心前瞻性研究,進一步驗證該結論,從而為OP患者的早期診斷提供理論基礎。