姜黃素調控KLF2表達對BV2細胞OGD模型中的作用及機制*

魏建明 曹湘玉 葉紫陽 楊 霞

湖南醫藥學院, 湖南省懷化市 418000

缺血性腦卒中(Ischemic stroke, IS)占腦卒中總數的70%～80%,具有高發病率、病死率、致殘率、復發率及年輕化趨勢等特點[1],已成為威脅人類健康的重要公共衛生問題。IS發生機制主要包括炎癥反應、氧化應激損傷、鐵死亡、細胞焦亡等,其中炎癥反應是關鍵機制之一。小膠質細胞作為中樞神經系統的免疫效應細胞,在調控神經炎癥方面發揮關鍵作用。研究表明腦缺血再灌注損傷后,腦缺血區小膠質細胞過度激活,加劇炎癥因子的釋放,導致腦缺血損傷導致神經元死亡[2]。Kruppel樣因子2(Kruppel-like factor 2,KLF2)是一類具有鋅指結構域的核轉錄因子,結合靶基因啟動子GC富含序列,調控相應基因的表達[3]。研究表明激活KLF2能抑制內皮細胞及巨噬細胞分泌的炎癥因子、趨化因子的表達,發揮抗炎作用[4]。姜黃素(Curcumin)是姜黃根莖的主要生物活性成分,有天然的抗氧化性、抗炎特性和抑制凋亡等多種生物學功能[5]。研究證實姜黃素對IS具有神經保護作用,但具體作用機制仍未明確[6]。本研究擬通過(Oxygen-Glucose Deprivation, OGD)模型模擬神經元缺血缺氧環境誘導BV-2小膠質細胞活化,觀察姜黃素對BV-2小膠質細胞損傷后的抗炎作用,探討KLF2是否介導姜黃素治療IS的神經保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 BV2細胞。小鼠源性BV2細胞(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫,批號SCSP-5208)。

1.1.2 試劑與儀器。 姜黃素(長沙鼎國生物技術有限公司),胎牛血清(美國Gibco公司),DMEM細胞培養基(美國Gibco公司),MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、ELISA試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司),KLF2-si RNA(上海吉瑪制藥技術有限公司),Lipofectamine2000試劑(美國Invitrogen公司),KLF2抗體(abs124444)、p-NF-κB抗體(SAB4301496)、NF-κB抗體(SAB4502615);酶標儀(美國BioTek公司)、Forma Steri-Cycle型CO2細胞培養箱(美國賽默飛公司)、凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養。BV2細胞采用含4.5g/L葡萄糖和10%胎牛血清的新鮮DMEM培養基在37℃、95%氧氣、5%CO2細胞培養箱進行培養,觀察細胞密度達到約90%以上進行消化,按1∶4比例進行傳代培養。

1.2.2 OGD建模及處理。將BV2細胞隨機分為正常培養的對照組(Control組)、氧糖剝奪模型組(OGD組)、姜黃素干預組(Cur組)。對照組在培養箱中正常培養細胞,模型組加入無糖DMEM培養基在37℃、95%氮氣、5%CO2環境中培養2h,然后更換含糖DMEM培養基并置于37℃、5%CO2環境中孵育24h。姜黃素組在構建OGD模型后采用不同濃度(1、5、10、20μmol/L)的姜黃素處理BV2細胞24h。

1.2.3 噻唑藍 (Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT)檢測BV2細胞活力。 將細胞接種于96孔細胞培養板,每孔細胞密度5×104個,每組各孔加入20μL的MTT溶液,37℃孵育4h,3 000r/min離心5min,吸取并棄去上清液,各孔再加150μL二甲基亞砜(DMSO)溶解,振蕩混勻10min,使用酶標儀在490nm波長處測定其吸光度(OD)。細胞活力=(OD值實驗組-OD值空白組)/OD值空白組,其中OD值實驗組為實驗組的吸光度,OD值空白組為空白組的吸光度。

1.2.4 Western blot檢測KLF2、p-NF-κB、NF-κB蛋白表達水平。將BV2細胞接種于6孔細胞培養板,細胞密度為106個/孔,加入600μL細胞裂解液,冰上裂解5min, 用細胞刮輕輕刮下細胞,收集于離心管中,4℃離心5min,取上清蛋白溶液,進行蛋白定量檢測,采用聚丙烯酰胺凝膠進行電泳后,切膠、轉膜,5%脫脂牛奶封閉2h,加入KLF2、p-NF-κB、NF-κB抗體(1∶1 000),4℃孵育過夜。用1×TBST洗膜3次,每次10min, 加入稀釋后的二抗溶液 (1∶5 000),室溫孵育1h,洗膜3次,用化學發光法分析儀顯影,使用Image J軟件進行條帶灰度值分析。

1.2.5 細胞轉染。將BV2細胞接種于6孔細胞培養板,細胞密度為106個/孔,24h后, 分別加入KLF2-siRNA或亂序-siRNA(SC-siRNA)孵育6h后,然后根據轉染試劑說明書步驟,使用Lipofectamine2000試劑進行輔助轉染,37℃孵育24h,Western blot檢測KLF2表達水平,以評價干擾效果,β-actin作為內參。

1.2.6 ELISA檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β水平。吸取各組細胞上清液至離心管中,4℃ 2 000r/min離心5min,小心吸取上清,分裝后-20℃凍存。取出ELISA試劑盒平衡至室溫,按試劑盒內說明進行操作。

2 結果

2.1 不同劑量姜黃素對OGD誘導的BV2細胞活力的影響 為觀察姜黃素對OGD誘導的BV2細胞的保護作用,我們將BV2細胞分為6組,分別為Control組、OGD組、OGD+1μmol/L Cur組、OGD+5μmol/L Cur組、OGD+10μmol/L Cur組、OGD+20μmol/L Cur組。MTT結果顯示(見表1):與Control組相比,OGD組BV2細胞活力顯著降低 (P<0.05),而與OGD組相比,OGD+10μmol/L Cur組、OGD+20μmol/L Cur組均可顯著升高BV2細胞活力 (P<0.05)。本研究還發現,在姜黃素的濃度為10μmol/L時,細胞存活率最高。因此,本研究后續的實驗選擇姜黃素的濃度為10μmol/L。

表1 不同劑量姜黃素對OGD誘導的B V2細胞活力的影響

2.2 姜黃素可調控OGD誘導的BV2細胞KLF2、p-NF-κB、NF-κB的表達 為探索KLF2是否介導姜黃素的神經保護作用,分別檢測Control組、OGD組和OGD+10μmol/L Cur組KLF2、p-NF-κB、NF-κB蛋白的表達。Western blot結果顯示 (見表2):與Control組相比,OGD組KLF2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),p-NF-κB蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),而姜黃素可顯著增加OGD誘導的BV2細胞KLF2蛋白表達(P<0.05),降低p-NF-κB蛋白的表達(P<0.05)。

表2 各組BV2細胞的KLF2、p-NF-κB、NF-κB蛋白表達比較

2.3 姜黃素可降低OGD誘導的BV2細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β的水平 為探討姜黃素在OGD誘導的BV2細胞的神經保護作用機制,分別檢測Control組、OGD組和OGD+10μmol/L Cur組炎癥因子TNF-α、IL-1β的水平,ELISA結果顯示(見表3):與Control組相比,OGD組炎癥因子TNF-α、IL-1β的水平顯著升高(P<0.05),而姜黃素可顯著降低OGD誘導的BV2細胞TNF-α、IL-1β的水平(P<0.05)。

表3 各組BV2細胞的TNF-α、IL-1β水平比較

2.4 KLF2- siRNA顯著逆轉了姜黃素對OGD誘導的BV2細胞的保護作用 為進一步研究KLF2在姜黃素保護OGD誘導的BV2細胞中的作用,采用KLF2-siRNA干擾BV2細胞KLF2的表達以評價干擾效果。先將細胞分為3組,分別為Control組、KLF2-siRNA組和SC-siRNA組。Western blot結果顯示(見表4):與Control組相比,KLF2-siRNA可顯著下調細胞KLF2蛋白表達水平(P<0.05),SC-siRNA未對KLF2表達產生顯著影響(P>0.05)。

表4 各組BV2細胞的KLF2蛋白表達比較

隨后,我們將細胞分為5組,分別為Control組、OGD組、Cur+OGD組、KLF2-siRNA+Cur+OGD組、SC-siRNA+Cur+OGD組。Western blot結果顯示 (見表5) :與Control組相比,OGD組p-NF-κB蛋白表達顯著增高(P<0.05),姜黃素組p-NF-κB蛋白表達顯著降低(P<0.05),KLF2-siRNA處理可顯著消除Cur對p-NF-κB表達的降低作用(P<0.05),SC-siRNA處理未對p-NF-κB表達產生顯著影響(P>0.05)。ELISA結果顯示(見表6):與Control組相比,OGD組炎癥因子TNF-α、IL-1β的水平顯著升高(P<0.05),而姜黃素可顯著降低OGD誘導的BV2細胞TNF-α、IL-1β的水平(P<0.05),KLF2-siRNA處理可顯著消除Cur對TNF-α、IL-1β水平的影響(P<0.05),SC-siRNA處理未對TNF-α、IL-1β的水平產生影響(P>0.05)。

表5 各組BV2細胞的KLF2、p-NF-κB、NF-κB蛋白表達比較

表6 各組BV2細胞的TNF-α、IL-1β水平比較

3 討論

缺血性腦卒中(IS)是由于腦部血管內發生缺血而造成大腦血液供應中斷和能量提供不足,可促使神經元發生不可逆性損傷壞死。目前主要通過靜脈溶栓及血管內再通治療以挽救缺血區腦細胞并改善神經功能,仍有部分患者遺留神經功能障礙。研究表明[7-8],炎癥反應是 IS的關鍵發病機制之一,而IS后炎癥反應造成的神經功能損傷與小膠質細胞過度激活密切相關,而抑制炎癥反應能保護神經元細胞和改善神經功能缺損,對IS的治療具有重要的意義。

據報道,姜黃素是姜黃的主要成分,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用,且具有親脂性,容易透過血腦屏障,有利于治療中樞神經系統疾病,尤其是腦血管疾病的治療[9]。TNF-α、IL-1β是機體重要的促炎細胞因子,在炎癥和免疫中起關鍵作用。研究表明急性腦梗死患者血清TNF-α、IL-1β水平明顯增高,且與病情嚴重程度呈正相關,提示TNF-α、IL-1β可用于急性腦梗死的程度判斷及預后評估[10-11]。研究表明[7],姜黃素能抑制小膠質細胞的活化及增殖,降低炎癥因子TNF-α、IL-1β的水平,對腦缺血再灌注損傷有一定的保護作用。研究表明,姜黃素通過抑制Toll樣受體4(TLR4)及炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表達,進而降低MCAO大鼠腦梗死體積,改善神經功能缺損起到腦保護作用。本研究顯示,姜黃素抑制ODG誘導的BV2細胞TNF-α、IL-1β的表達,減輕炎癥反應而發揮神經保護作用,與上述研究[7-8]報道一致。

KLF2是一種鋅指轉錄因子,可調節炎癥反應、細胞凋亡和增殖等細胞應激過程,參與多種疾病的病理生理發展過程。研究發現[12-13]急性腦梗死患者血清KLF2下降,隨著梗死面積增大,KLF2水平降低,且與病情嚴重程度呈負相關,表明血清KLF2水平是評估急性腦梗死的病情嚴重程度的重要指標之一。研究表明,在腦出血大鼠模型中,去泛素化酶USP11表達增高,抑制KLF2表達,激活核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路,引起小膠質細胞活化,增強促炎介質IL-1β、TNF-α的釋放,導致腦出血后炎癥[14],而下調USP11表達,促進KLF2表達,能明顯減輕炎癥反應。Shi 等[15]在大鼠肺組織纖維化模型中發現,過表達KLF2可減輕肺間質的破壞和膠原增生,抑制促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的合成與釋放,減輕炎癥反應,改善肺組織纖維化和肺組織損傷。研究表明[16],姜黃素能抑制豬脂肪間充質干細胞(AMSCs)的增殖和成脂分化作用與其增加KLF2 mRNA的表達相關。本研究結果顯示,姜黃素能上調KLF2表達,抑制炎癥因子的釋放;而下調KLF2表達,姜黃素產生的上述保護作用也隨之消失。由此可見,KLF2可能介導了姜黃素對OGD誘導BV2細胞損傷的神經保護作用。

NF-κB是一種轉錄調節蛋白,參與調節腦缺血缺氧后炎癥反應并釋放促炎細胞因子、趨化因子及黏附分子等[17]。徐飛飛等[2]研究發現腦缺血時小膠質細胞中的NF-κB被激活后,炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-18的合成和釋放增加,同時這些促炎細胞因子又可以激活NF-κB,從而使該過程在腦細胞間不斷擴散,加重炎癥反應。研究表明[18]KLF2能直接與p300及其相關因子PCAF相互作用來抑制NF-κB轉錄活性,負調控炎癥反應發揮抗炎作用[19-20]。有研究證實[21],姜黃素通過抑制NF-кB的激活以減輕阿爾茨海默病(AD)大鼠大腦中的炎性反應,提高其學習記憶能力。本研究結果顯示,姜黃素上調KLF2表達,降低促炎細胞因子TNF-α、IL-1β的水平,可能是通過抑制NF-κB信號通路來實現對神經元缺血缺氧損傷的神經保護作用。另有研究表明[22]姜黃素減輕腦梗死后炎癥反應,其機制可能與其阻斷NLRP3/Caspase-1信號通路有關。結合本研究和其他學者的研究,可以確定姜黃素能通過多種信號通路對腦缺血再灌注損傷發揮神經保護作用。

綜上所述,姜黃素對OGD誘導的BV2細胞發揮神經保護作用,可能是通過上調KLF2,抑制NF-κB信號通路,降低炎癥因子TNF-α、IL-1β的水平,以減輕腦缺血再灌注損傷。本研究為探索姜黃素的現代應用提供新靶點,也為IS治療提供理論支持、實驗依據及帶來臨床應用前景。