實驗動物血清膠凍樣成因分析及消除方法探索*

饒玉良 馬淑蘭 張亞東 王見之 王 浩 嚴鈺鋒

復旦大學基礎醫學院,上海市 200032

動物血清是常用的實驗材料,血清質量往往決定實驗數據的準確性和科學性。動物血清制備常出現一些異常情況,如血清析出,但呈膠凍樣血清。膠凍樣血清對血清學檢測過程和數據造成很大影響,嚴重干擾實驗結果。減少血清膠凍樣的形成,對涉及血清學檢測的實驗都具有重要意義。本文基于血液凝固機制,重點分析實驗動物血清膠凍樣的成因,并探索消除血清膠凍樣的系列方法,減少血清膠凍樣的形成,對于血清學檢測具有重要的意義。

1 動物血清及其制備

血清學檢測不同指標可反映動物生理和病理狀況,對疾病檢測診斷、動物模型復制、疾病機制研究、治療效果評價等,具有重要意義。

1.1 血清組成成分 血清呈淡黃色,為血液凝固后析出透明液體,不含纖維蛋白原,能維持血液黏度、酸堿度、滲透壓等。血清成分復雜,包含水、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白、白蛋白、谷丙轉氨酶、甘油三酯、總膽固醇、多肽等,還含有尿素氮、肌酐、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等。血清成分及含量常常變化,與供血動物性別、年齡、生理、病理和營養狀況等有關。凝血時血小板釋放大量物質,凝血因子也都發生變化,血清成分發生改變。纖維蛋白原活化為成纖維蛋白,與血漿顯著區別是血清無纖維蛋白原。動脈血和靜脈血的血清成分上也會有區別。

1.2 血清析出過程 血液凝固有三個過程:凝血酶原激活物形成、凝血酶形成、纖維蛋白形成,最根本的是血漿可溶性纖維蛋白原活化成不可溶的纖維蛋白。血液樣本在未加抗凝劑的情況下,血小板破裂釋放凝血激活酶,在系列凝血因子參與下,凝血酶原活化為凝血酶,纖維蛋白原活化為纖維蛋白單體;凝血酶激活凝血因子ⅩⅢ為活性凝血因子ⅩⅢa,纖維蛋白單體聚合為不溶纖維蛋白多聚體,交織成網狀,血細胞、血小板被網羅其中,血凝塊形成,淡黃色透明的血清析出。

1.3 血清制備方法 根據實驗動物、采血部位和采血要求的不同,采血方式方法也不同。若采用一次性注射器從動物血管中吸出血液后,取下針頭,將血液沿著離心管壁緩緩注入離心管,離心管室溫靜置2～4h,或37℃水浴或恒溫箱預處理0.5～1h。待血清析出后,3 000～4 000r/min離心10min,上清即為澄清透明的淡黃色血清。

2 血清膠凍樣物質的成分分析

凝血是復雜的反應過程,最終表現為血凝塊形成和血清析出。采血后血液未完全凝固就離心,使紅細胞、活化血小板離開纖維蛋白網,紅細胞、活化血小板沉積,而纖維蛋白因缺乏磷脂表面,無法收縮沉積,且其比重較小,離心后留在血清層,形成膠凍樣[1]。

血清膠凍樣物質的具體成分目前還未見相關研究報道。根據血液凝固和血清析出的機制推測,膠凍樣物質可能是膠原蛋白、纖維蛋白原,或活化但尚未收縮的纖維蛋白。部分膠凍樣血清是因供血動物過于肥胖、脂肪過多,纖維蛋白及脂肪過多聚集于血清,而形成膠凍狀血清[2],顯示血清膠凍樣的形成與脂肪可能有關。

3 血清膠凍樣的成因分析

實驗動物采血制備血清時,會遇到有血清析出但血清呈膠凍樣不能吸出的現象,也曾遇到血清澄清透明但吸出后變成膠凍樣的現象。動物血清呈膠凍樣主要包括以下原因。

3.1 血液靜置時間短 采血后,血液在離心管或采血管內啟動凝血過程,纖維蛋白原在凝血酶作用下活化為纖維蛋白,纖維蛋白單體交聯,交織成不溶的網狀纖維蛋白多聚體,血細胞被網羅于內,血凝塊形成,血清析出。采血后放置時間不夠長,血液凝固不完全就離心,易形成膠凍樣血清[3]。

3.2 溫度不合適 血液樣本放置的環境溫度也會影響血清析出。冬季氣溫低,酶活力低,血液中纖維蛋白原不易充分活化、成網、沉淀,易導致膠凍樣血清形成,故冬季膠凍樣血清更易出現。環境溫度過高,也可能因血液水分揮發,血清缺水而形成膠凍狀[4]。

3.3 食物和營養狀況的影響 動物進食后,機體各器官功能活躍,血液成分含量變化較大,進食后采血更易出現膠凍樣血清。采血時間宜在進食前或進食2h后,畜禽宜禁食8h(空腹)后再采血,常早晨或午后采血。禽類24h內喝水太少,血清也不易析出。常高蛋白質高脂肪飲食,動物容易營養過剩、高血脂,血液中纖維蛋白和脂肪過多,易出現乳白色膠凍樣血清。

3.4 動物品種的影響 實驗動物常用家兔、大鼠、小鼠、豚鼠、蟾蜍等,也會用到牛、豬、狗、雞、鴨等。雞血清更易出現膠凍狀[4],鵝、鴨類本來就血脂高,易形成膠凍,可以采前多飲水來改善。 實驗動物性別、年齡、生理、病理和營養狀況等因素影響血清構成成分及含量,不同的實驗動物個體血液狀況不同,有些更易形成膠凍樣。

3.5 采血部位的影響 不同的采血部位,也可能影響血清膠凍樣的出現。動脈血和靜脈血成分不同,血清析出也會有影響,因此,動靜脈采血部位對血清制備也有影響。不同品種動物采血部位不同,也會有影響。豬的前腔靜脈和耳靜脈均可采血,前腔靜脈通常用于大批量采血。禽翅膀內側腋下靜脈和心臟均可采血,翅膀內側腋下靜脈常用,心臟采血多見于對淘汰禽檢測或技能競賽。牛頸靜脈和尾根靜脈可采血,奶牛多尾根靜脈采血,羊頸側靜脈采血常用。

3.6 采血器材的影響 使用一次性的真空采血裝置采血,若采血后活塞未打開一定空隙,血清便不容易分離出來;采用注射器采集血液后,如果未取下針頭便快速將血液推入離心管,易導致溶血及血清渾濁;若采用抗凝管采血,則會影響血液凝固血清析出。玻璃試管血清析出的效果比塑料離心管好,膠凍較少。若采用促凝管采血,管內促凝劑會加速血液凝固,更快更好地獲取血清。采血量以采血管容積的1/3為宜,不宜超容器2/3。大、中型實驗動物全血量不少于5mL。為保障充足的血清量,大、中型實驗動物析出血清不宜少于1mL,禽及寵物血清量不宜少于0.5～1mL。采血量少、采血斷斷續續、抗凝管采血,易導致血清量不足或膠凍樣。

3.7 影響因素 動物實驗中,尤其介入性手術操作,易引入抗凝物質,對血清會產生影響。采血部位酒精未完全揮發時采血,酒精可能滲入血液, 血清更易出現膠凍樣。 疾病也容易導致血清呈膠凍樣。漿細胞疾病(如多發性骨髓瘤等)會引起漿細胞異常增殖,單克隆免疫球蛋白增多,異常免疫球蛋白或片段劑量過量而沉淀,可導致組織變性以及淋巴細胞浸潤,引發器官功能障礙。免疫球蛋白濃度過高,增加血液黏稠度,導致廣泛病理損傷。多發性骨髓瘤患者血管內皮細胞生長因子和組織因子等水平升高,大量M蛋白與纖維蛋白原相互作用, 損傷纖維蛋白的聚合作用,引起患者血清易出現膠凍樣[5]。

4 血清膠凍樣的消除方法

4.1 加強動物免疫和科學飼養 根據動物種類和免疫要求,科學規范免疫,確保實驗動物健康。科學合理均衡飼喂,確保動物營養均衡和生理指標的正常。對于特殊模型動物,按照建模要求科學制定建模方案。

4.2 嚴格注意采血時機、溫濕度和放置時間 通常早晨或午后,動物空腹或禁食8h后采血,盡可能減少攝食對血液的影響。血清制備與環境溫濕度關系密切。采血過程中注意樣品保溫,尤其冬季,采樣時可在采樣箱內放置保暖袋,溫度控制在37℃左右。采樣后將樣品37℃培養箱中放置1～2h,待血清析出后,3 000～4 000r/min離心10min。若離心前血清析出良好,離心后裝入離心管內形成凝膠,可在不影響后續實驗的前提下,放置在56℃水浴鍋或金屬浴鍋中加熱0.5h,促進纖維蛋白凝結[6]。若時間到仍有凝膠,可適當延長加熱時間。

4.3 采血操作科學規范 根據動物種類和血清要求,選擇合適采血方式、采血部位和采血器材。使用一次性真空采血器采血后,將采血器活塞盡可能拉到最大刻度,套上針頭帽,采血器針頭朝上自然傾斜30°～45°角靜置[7],血清自然析出,血液樣本避免陽光直射[8]。離心過程時,放置在離心機轉子外圈離心孔中也能在一定程度減少膠凍血清的出現。

4.4 適度混勻有利于血清形成 動物采血后,顛倒混勻血液樣本,再靜置于室溫或孵育箱,待血液完全凝固血清析出后再離心。若采血后樣本直接靜置,不顛倒混勻,血液樣本的細胞成分自然沉降,血液凝固,血液細胞成分和血清分離,有時也不易通過離心獲得合格血清。

4.5 其他解決方案 動物實驗中,如出現完全膠凍樣血清,可采用無菌針頭或移液槍槍頭將膠凍樣物質挑出,再靜置或離心,血清便再次分離出來。若某采血部位分離的血清易呈膠凍樣或混濁,更換采血部位也可得到理想血清。

5 討論

在現代科學研究中,動物血清是常用的實驗材料,血清質量的好壞往往直接影響實驗過程和實驗結果。動物血清制備過程中,常因血液靜置時間不夠長、溫濕度因素、動物種屬、個體差異、飲食和營養狀況、疾病狀況、采血部位、采血器材、藥物因素等影響,血清可能呈膠凍樣,或完全凝固沒有血清析出,必然會影響血清學試驗及血清成分檢測。血清質量是血清學檢測的前提,因此,對血清膠凍樣成因分析和探討消除辦法,對于血清學檢測具有重要的意義。實驗動物血清廣泛應用于各種血清學檢測,不僅適用于科學研究和實驗教學,還適用于動物疫病檢測、免疫效果評價等多種場景,在傳染性疾病防控、畜牧養殖業等廣泛應用。因此,分析血清膠凍成因,探索消除膠凍樣血清的方法,減少血清膠凍樣的形成,具有重要的現實意義。

本文通過對血清膠凍成因的系統分析,梳理歸納血清膠凍的主要成因,并據此提出消除膠凍的相應解決方案,對動物實驗中減少膠凍樣血清有積極作用。然而,由于動物個體差異等因素,以及還未完全掌握血清膠凍的成因等多方面原因,還沒有真正意義上完全解決血清膠凍的形成,還有待后續繼續研究機制和不斷積累解決方案。