宏基因組二代測序技術在血液病患者合并感染診療中的應用

封 韜,付 堃,張智慧,蘆小單,高 鵬

(1.吉林省人民醫院血液科,吉林 長春 130021;2.吉林省人民醫院精準分子醫學中心,吉林 長春 130021)

血液病尤其是惡性血液病患者,由于腫瘤細胞惡性克隆性增生、骨髓正常造血功能被抑制、免疫細胞功能受抑等原因,病程中常伴隨感染、出血、肺部彌漫性損傷及多器官功能障礙等嚴重并發癥。其中感染是導致病情加重甚至死亡的主要原因之一[1]。此外,患者接受化療、使用糖皮質激素及免疫抑制劑等治療措施,可導致病人黏膜免疫屏障受損,免疫細胞功能受抑進一步加劇,因此惡性血液病患者的感染發病率較高,甚至導致死亡。血液病合并感染可發生于任何組織器官,以肺部、血液、口腔及肛周最為常見,主要病原微生物包括細菌、真菌及病毒等。病原微生物通過各種途徑進入血液循環,可導致血流感染,甚至可引起感染性休克、彌散性血管內凝血、多臟器功能衰竭乃至死亡[2]。

宏基因組二代測序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)是精確診斷感染的關鍵驅動力,可一次性對數百萬甚至千萬個DNA序列進行測序,對DNA的序列分子進行讀取,獲得豐富的遺傳學信息的同時,還可大大降低測序費用、縮短測序時間,一次檢測大量靶基因[3]。此外,mNGS涵蓋耐藥基因檢測,可以在檢出病原體的同時提示其可能存在的耐藥性,指導臨床合理選擇敏感抗生素[4]。本研究對血液病合并感染患者的傳統病原體檢測結果和mNGS檢測結果進行比較,探討mNGS檢測對血液病合并感染在診療及臨床用藥等方面的優勢及臨床應用價值,為血液病患者感染類疾病的診斷提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年8月至2022年12月吉林省人民醫院血液科血液病合并感染患者作為研究對象,根據研究需要納入患者20例,納入標準為:(1)依據MICM分型、病理學等實驗室檢查,明確診斷為血液系統疾病的患者,腫瘤性疾病優先;(2)住院期間出現持續或間斷發熱、臨床診斷為病原微生物感染、常規實驗室檢測病原菌并給予經驗性抗生素治療后療效欠佳者,送檢標本行mNGS檢測。排除標準為:(1)未明確診斷血液惡性腫瘤或伴有其他惡性腫瘤疾病患者;(2)生命體征不穩定或心肺功能不全的患者;(3)無常規實驗室病原體檢測結果的患者。

1.2 方法

宏基因組測序:(1)總DNA提取及DNA文庫構建:應用自動化提取建庫儀制備文庫,采用熒光定量PCR進行文庫定量;(2)上機測序:應用NextSeq CN500測序儀(美國Illumina公司)對構建好的DNA文庫進行測序;(3)生物信息學分析:對讀取的文庫序列數據進行生物信息學分析,過濾其中的人類基因組序列數據,將其余序列數據與微生物參考數據庫進行比對,從而確定病原體物種及其相對豐度。

1.3 統計學處理

應用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析,單因素分析采用卡方檢驗,P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 研究結果

2.1 臨床特征

共納入患者20例,其中男性8例,女性12例,中位年齡為53.5歲。血液病類型包括:骨髓增生異常綜合征1例,急性髓系白血病6例,急性淋巴細胞白血病2例,再生障礙性貧血3例,淋巴瘤2例,免疫性血小板減少癥1例,骨髓纖維化2例,自身免疫性溶血性貧血1例,不明原因貧血2例。標本送檢前所有患者均出現不同程度發熱、血常規及其他感染指標異常、懷疑嚴重感染且經驗性抗感染治療效果不佳等狀況。

2.2 mNGS與常規檢測方法結果的比較及治療轉歸

在20例出現感染的患者中,16例(80%)患者的mNGS結果呈陽性,4例(20%)呈陰性;3例(15%)患者的傳統檢測結果呈陽性,17例(85%)患者檢測結果呈陰性,說明mNGS陽性檢出率大于傳統檢測結果(P<0.05)。其中3例mNGS結果與傳統檢測結果均為陽性,13例僅mNGS結果呈陽性,4例mNGS結果與傳統檢測結果均為陰性,兩種檢測方法的一致性較差(P>0.05)。

患者入院時,依據病史、臨床表征以及常規檢測結果,臨床給予基礎經驗性抗感染治療。mNGS檢測結果回報后,臨床依據檢測結果調整用藥方案,最終12名患者明顯好轉,8名患者死亡。回溯分析發現,在感染早期進行mNGS的檢測,對改善患者預后、提高生存率具有重要意義。

2.3 mNGS 與常規檢測方法結果的病原體分布比較

在20例患者中,mNGS直接檢出病原菌16例,未檢出4例,其中單純細菌感染3例(18.8%)、單純真菌感染1例(6.2%)、單純病毒感染4例(25%)、兩種以上感染8例(50%)。mNGS檢測出病原菌的16例中,檢出細菌12種、真菌8種、病毒7種。通過傳統檢測血培養檢出病原菌3例, 未檢出17例,其中細菌3種、真菌1種、病毒0種,兩種檢測方法的病原體檢出結果見表1。

表1 兩種檢測方法檢出病原菌種例數

檢出率最高的為細菌類(44.5%),其次為真菌類(29.6%),檢出率最低的是病毒類(25.9%),細菌類銅綠假單胞菌的檢出率較高,其他菌株種類較分散;真菌類煙曲霉檢出率較高,其次為黃曲霉和白色念珠菌、耶氏肺孢子菌;病毒中以人皰疹病毒4型、人皰疹病毒5型最常見。

2.4 不同樣本的mNGS檢測結果陽性率比較

采用mNGS檢測肺泡灌洗液、痰液、組織的陽性率為100%,而血樣本的陽性率為55%,相較于肺泡灌洗液、痰液、組織等局部標本的檢出率明顯下降,差異有統計學意義(P<0.05)。表明相較于血液樣本,肺泡灌洗液、房水、痰液等采集于局部病灶的樣本檢出率更高、檢測效果更好。

2.5 mNGS檢測結果中耐藥基因的分布

mNGS檢測在檢測樣本中是否含有致病菌的同時,還可對患者是否存在耐藥基因進行檢測。20例患者中,2例檢測出耐藥基因,1例對大環內酯類、林可酰胺類、鏈陽霉素以及頭孢霉素抗生素耐藥,1例對肽類、氟喹諾酮類、利福霉素、四環素類、大環內酯類、林可酰胺類、鏈陽霉素、頭孢霉素、碳青霉烯類、青霉烷類、砜類以及磺胺類耐藥。相較于傳統檢測方法,mNGS可全面檢出患者存在的耐藥基因,可及時、準確地給予臨床用藥指導,對患者的治療具有重要價值。

3 討論

血液病患者由于其疾病的自身特點,以及治療過程中使用大量的激素、免疫抑制劑及化療藥物等,易造成黏膜屏障破壞,免疫功能損傷繼而引發感染等并發癥,感染是造成患者治療失敗甚至死亡的主要原因之一[5]。然而血液病患者的感染常伴有病原菌檢出率低、病情進展快、臨床經驗性治療效果欠佳等問題,因而在感染早期快速、準確地檢出致病菌,在早期給予干預,對患者的治療及預后具有重大意義。

細菌培養是病原體檢測的傳統方法,用于培養的樣本包括外周血、痰液、體液等,然而細菌培養的靈敏度較低,且受技術影響部分病原菌培養困難,限制了其在精確診療中的廣泛應用。研究發現,AHO患者外周血的細菌培養敏感性不足50%[6]。而mNGS作為高通量測序技術,被認為在病原體檢測中發揮重要作用[7]。相比于傳統病原體檢測方法,mNGS的靈敏度高,在細菌病毒等載量較低時,即可精確診斷,指導臨床在感染早期予以控制,療效顯著。ZHANG等[8]研究發現,mNGS可精準診斷細菌培養尚為陰性的隱球菌感染所致骨髓炎。CHEN等[9]研究表明,針對外周血的mNGS檢測可早期診斷重癥肺炎患者的血流感染。

本研究將傳統病原體檢測方法和mNGS檢測進行對比,結果顯示mNGS在檢出率(80%)以及檢出病原菌的豐富度方面均優于傳統檢測方法。此外,20例患者樣本中血液樣本的檢出率為55%,顯著低于局部病灶的樣本檢出率(100%)。針對感染傳統的檢測手段主要是血培養、痰培養,然而20例樣本中17例樣本的血、痰培養為陰性,顯著低于mNGS的檢出率,血培養敏感度低,在感染早期易造成漏診,可能延誤病情,對患者的治療及預后不利。此外,結果表明,在出現感染的患者中,多為細菌、真菌及病毒兩種或兩種以上混合型感染,給臨床的診療及用藥帶來了巨大的阻力。同時,真菌及病毒培養困難,因此傳統的細菌培養難以檢出或僅檢出部分病原體,而mNGS檢測具有準確度高、覆蓋面廣等優點,對臨床進一步優化用藥方案、提高患者整體預后具有重要意義。

通過與傳統病原體檢測手段作比較,證實了mNGS具有覆蓋面廣、靈敏度高等優點,對臨床診療具有重要指導意義,但本研究樣本數量有限,得出的結論僅為mNGS的研究提供部分理論基礎,未來將繼續深入研究mNGS在病原體篩查診斷中的作用。目前mNGS技術尚處于快速發展階段,在藥敏和毒力基因檢測等方面仍存在局限性[10],因此尚不能作為臨床診療的獨立依據,應結合臨床表征進行甄別、診斷。隨著技術的飛速發展、臨床經驗的不斷積累,未來mNGS將廣泛應用于臨床診療,以綜合判定病情,及時為患者提供個體化治療方案。