基于氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的猴頭菇多糖抗疲勞代謝組學(xué)

任卓妍, 肖炳坤, 繆瀟瑤, 李志恒, 黃榮清*

(1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院, 廣州 511436; 2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所, 北京 100850)

猴頭菇(Hericium erinaceus)是中國八大“山珍”之一,也是一種珍貴的藥食兩用大型真菌[1]。猴頭菇提取物[2]有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、增加免疫力等功效。早在370年前明代徐光啟的《農(nóng)政全書》中就有猴頭菇的記載;傳統(tǒng)中醫(yī)認為,猴頭菇性平、味甘,有助消化、利五臟、潤六肺的功能和補虛損的功效。猴頭菇的菌絲、發(fā)酵液與子實體中都含有多糖,是目前研究最多的猴頭菇的活性成分之一[3]。經(jīng)王趁芳等[4]研究發(fā)現(xiàn),猴頭菇多糖對免疫水平、腫瘤發(fā)生、激素分泌、血糖水平等均可產(chǎn)生有益作用,可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥及保健食品領(lǐng)域。

近年來,由于社會壓力倍增,互聯(lián)網(wǎng)、電子設(shè)備的普及等使人們長期缺乏睡眠;過度勞累、飲食不規(guī)律、運動過量等因素致身體出現(xiàn)體力、精力不足等疲勞癥狀。美國疾病控制和預(yù)防中心(Centers for Disease Control and Prevention,CDC)于1988年正式提出慢性疲勞綜合征[5](chronic fatigue syndrome,CFS)的病征名稱。CFS[6]也稱為肌痛性腦脊髓炎(ME)或全身性運動不耐受疾病;臨床上,ME/CFS以慢性(超過6個月)多系統(tǒng)癥狀為特征,包括運動后不適(post-exertional malaise, PEM)、睡眠不清醒、明顯疲勞、疼痛、肌肉無力和認知障礙[7];除疲勞外,其癥狀還可能包括疼痛、睡眠障礙、焦慮、抑郁等[8]。目前CFS的病因病機尚不明確,且缺乏統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)、成熟有效的治療方案。西醫(yī)主要是對癥治療,治療效果并不理想;中醫(yī)在整體觀念和辨證論治理念的指導(dǎo)下,運用中藥、針灸、推拿等中醫(yī)療法均能不同程度地改善慢性疲勞的癥狀,對于治療 CFS 有顯著優(yōu)勢[9]。

“疲勞”始見于《金貴要略》:“夫尊榮人骨弱肌膚盛,重因疲勞汗出,臥不時動搖,加被微風(fēng),遂得之?！备鶕?jù)其臨床表現(xiàn),CFS可歸入中醫(yī)學(xué)“虛勞”“五勞”“郁證”等范疇[10]。中藥“多組分、多靶點、整體調(diào)節(jié)”的特點及中醫(yī)藥理論的“整體觀”“辨證論治”與代謝組學(xué)的全景式、整體互動性、綜合性基本相符合,且代謝組學(xué)在中藥方面研究也較成熟廣泛。對猴頭菇多糖具有抗疲勞作用[11-13]的相關(guān)研究都是從生化指標(biāo)來解釋抗疲勞作用的機制,并沒有解釋機體的整體物質(zhì)基礎(chǔ)變化,并沒有中醫(yī)整體性相關(guān)的研究,具體代謝途徑的作用機制也尚不明確?，F(xiàn)開展對猴頭菇多糖抗疲勞代謝組學(xué)研究,采取控制飲食結(jié)合負重力竭游泳大鼠疲勞模型[14],運用GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)分析動物代謝輪廓變化,尋找差異性代謝物,構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò),從整體分子水平闡釋猴頭菇多糖抗疲勞機制,以期為猴頭菇多糖治療慢性疲勞綜合癥的現(xiàn)代開發(fā)和應(yīng)用提供參考,在中醫(yī)治療疲勞及代謝通路的闡釋方面具有一定的新穎性和前瞻性。

1 實驗材料

1.1 動物

SD雄性大鼠36只,體重180～220 g,動物許可證號:SCXK(京)2019-0010,實驗動物基礎(chǔ)飼料均由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(25±3) ℃,濕度45%～60%,每天進行12 h光/暗循環(huán),自由進食飲水,實驗開始前適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 儀器

GCMS-QP2010SE氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司);victorX5酶標(biāo)儀(美國PerkinElmer有限公司);BP211D型Startbrius天平(德國Sartorius公司);IDZ5-2型離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);QL-901vortex渦旋儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);SB-5200DTDN型超聲波清洗機(寧波新藝生物科技股份有限公司);大鼠代謝籠(北京龍東海設(shè)備制造有限公司);高速冷凍離心機(美國賽默飛科技有限公司);NV-15G氮吹儀(上海安譜科學(xué)儀器);RES2CS-2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);BC-2600 全自動血細胞分析儀(邁瑞有限公司);B-260恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠);German/Asp 300S全封閉式自動脫水機(Leica);German/HistoCore AUTOCUT+ HistoCore Arcadia全自動輪轉(zhuǎn)切片工作站(Leica);German/ST5020+TS5025+CV5030全自動多功能染色蓋片一體機(Leica);HI1220烘片機(Leica);HI1210撈片機(Leica);Primo star正置顯微鏡(Zeiss)。

1.2.2 試劑

猴頭菇(采購于吉林省長白山);紅景天(采購于北京同仁堂);生理鹽水(華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司,批號:Y1901241);乙腈(美國SigmaAldrich有限公司,批號:WXBB6215V);甲醇(美國Sigma-Aldrich有限公司,批號:WXBB6447V);普通氮氣(純度≥99.2%)、高純氦(純度≥99.999%)購自北京環(huán)宇京輝京城氣體科技有限公司;Harris蘇木素(BASO,批號:C201002);伊紅染液(BASO,批號:C201201);二甲苯(滬試,批號:10023418);衍生化試劑(Thermo scientific,批號:WB315053);大鼠5-羥色胺(5-HT)試劑盒(卡米諾,批號:2R-KMLJr30019)。

2 實驗方法

2.1 猴頭菇多糖制備

參照王秉伋等[15]猴頭菇多糖的提取制備,取猴頭菇干燥品1 kg,剪碎加水浸泡后水煮3次,每次1 h;合并提取液濃縮到1∶1,加乙醇到30%乙醇濃度,離心除去沉淀(2 500 r/min)20 min;向上清液加三倍量95%乙醇沉淀多糖;將上步得到的粗多糖溶于水,用乙醇再重復(fù)沉淀一次得到淺黃色固體粉狀多糖46 g,提取率為4.6%。

2.2 動物分組與模型建立

采用隨機數(shù)字表法將36只大鼠分為空白(BG)組、模型(MG)組、猴頭菇多糖低劑量(LD)組、猴頭菇多糖中劑量(MD)組、猴頭菇多糖高劑量(HD)組、紅景天陽性對照(PG)組6組。大鼠常規(guī)飼養(yǎng)5 d適應(yīng)環(huán)境。按照藥理試驗中等效劑量換算[16]:設(shè)置為低劑量組100 mg/kg;中劑量組200 mg/kg;高劑量組400 mg/kg;紅景天陽性對照組2 g/kg,均為灌胃給藥方式。于實驗第1天開始灌胃給藥,連續(xù)21 d,并于末次給藥30 min后,按照大鼠自身體重的5%負重釣魚用鉛皮,固定于距大鼠尾根部約2/3處,并將每只大鼠置于盛水塑料大桶中,水溫(25±5) ℃,進行力竭游泳實驗;同時控制實驗組飲食。

2.3 力竭游泳時間比較

除空白組以外各組大鼠于第1、3、5、7、9、12、15、18、21天進行負重力竭游泳;稱量體重并灌胃后,進行負重力竭游泳實驗,以大鼠不斷下沉且10 s內(nèi)頭部未露出水面,記錄第一次力竭時間[17]。最后一次于30 min內(nèi)腹主動脈取全血至10 mL離心管內(nèi),待檢測。

2.4 GC-MS檢測血清中的代謝物

2.4.1 血清前處理

將取得的負重力竭游泳大鼠血樣進行離心,取上清液至離心管內(nèi)于-20 ℃冰箱冷凍保存,備用。血樣室溫下解凍,取100 μL～2 mL EP管,加1 200 μL甲醇沉淀蛋白,渦旋30 s,超聲10 min混勻,12 000 r/min離心15 min,取上清液100 μL～2 mL衍生化樣品瓶中,以氮氣揮干后,加20 mg/mL(現(xiàn)配)甲氧胺吡啶鹽酸鹽溶液50 μL渦旋復(fù)溶,70 ℃水浴條件下肟化1 h。冷卻至室溫,加入衍生化試劑BSTFA+TMCS(99∶1)50 μL,渦旋30 s,70 ℃水浴條件下衍生化反應(yīng)1 h。冷卻后加入正庚烷100 μL,渦旋30 s混勻,取上清液置氣質(zhì)進樣瓶中待檢測分析。

2.4.2 GC-MS分析參數(shù)

Rtx-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進樣口溫度280 ℃,采用10∶1的分流比,載氣為99.99%氦氣,流速保持1.0 mL/min;柱溫程序:起始溫度80 ℃(保持5 min),以5 ℃/min的速度上升到300 ℃(保持15 min);進樣量1 μL。EI源溫度為230 ℃、電壓70 eV;四極桿溫度150 ℃;質(zhì)譜掃描離子范圍:50～1 000m/z;溶劑切除時間為4 min[18]。

2.5 5-HT水平

由于模型組大鼠出現(xiàn)過度興奮、大量飲水、拒絕食物等焦慮現(xiàn)象,將6組大鼠血清按酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒說明書檢測5-HT含量。

2.6 組織切片

模型組大鼠解剖后發(fā)現(xiàn)胃部充水膨脹,取大鼠腦、胃固定于4%多聚甲醛溶液中;石蠟切片脫蠟至水后入Harris蘇木素染色5 min后使用自來水洗數(shù)遍;入鹽酸酒精分化1 s;在溫水中返藍數(shù)秒(鏡下觀察核仁的清晰程度)后經(jīng)室溫蒸餾水清洗1 s;入醇溶性伊紅染液中40 s水洗2 s;梯度酒精脫水,二甲苯透明;中性樹膠封片。

2.7 數(shù)據(jù)處理與分析

2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

3 實驗結(jié)果

3.1 猴頭菇多糖對大鼠體重的影響

各組灌胃給藥期間體重數(shù)據(jù)記錄如表1所示,經(jīng)配對t檢驗后,發(fā)現(xiàn)模型(MG)組與空白(BG)組具有顯著性差異(P<0.01),說明模型可能造成大鼠體重降低。猴頭菇多糖低、中、高劑量組與MG組有顯著差異(P<0.01),推測疲勞模型大鼠體重恢復(fù)程度可能與猴頭菇多糖給藥劑量增加成正比,在猴頭菇多糖劑量為400 mg/kg時大鼠體重與空白組大鼠體重最為相似。

表1 體重數(shù)據(jù)統(tǒng)計比較Table 1 Statistical comparison of body

3.2 猴頭菇多糖對大鼠力竭游泳時間的影響

如表2所示,21 d力竭游泳時間模型組與給藥各組相比,高劑量組表現(xiàn)出極顯著差異;給予猴頭菇多糖灌胃的各組中,與模型組相比高劑量組的大鼠負重游泳時間顯著延長(P<0.01)。表明在一定劑量范圍內(nèi)下,猴頭菇多糖能夠有效緩解運動疲勞并提高大鼠力竭游泳時間。且大鼠負重游泳時間與猴頭菇多糖攝入量呈劑量依賴關(guān)系。

表2 力竭游泳時間對比Table 2 Comparison of exhaustive swimming time

3.3 猴頭菇多糖對大鼠血清5-HT含量的影響

如表3所示,模型組與給藥各組相比,模型組表現(xiàn)出極顯著差異;模型組大鼠血清中5-HT含量較其他各組顯著增高。表明過度疲勞可能使大鼠血清中5-HT含量發(fā)生顯著變化,推測過度疲勞可能導(dǎo)致大鼠過度興奮表現(xiàn)為焦慮癥狀。

表3 5-HT含量數(shù)據(jù)統(tǒng)計比較Table 3 Statistical comparison of 5-HT

3.4 猴頭菇多糖對大鼠胸腺指數(shù)的影響

各組灌胃給藥21 d后胸腺指數(shù)數(shù)據(jù)記錄如表4所示,經(jīng)配對t檢驗后,顯示空白(BG)組與模型(MG)組具有顯著性差異(P<0.01),說明模型造成胸腺指數(shù)降低。HD組與BG組無顯著差異,MG組大鼠胸腺指數(shù)明顯低于其他組。推測經(jīng)過猴頭菇多糖干預(yù),疲勞模型大鼠胸腺增長可能恢復(fù)至正常狀態(tài)。

表4 胸腺指數(shù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計比較Table 4 Statistical comparison of

3.5 猴頭菇多糖對大鼠脾臟指數(shù)的影響

各組灌胃給藥21 d后脾臟指數(shù)數(shù)據(jù)記錄如表5所示,經(jīng)配對t檢驗后,顯示空白(BG)組與模型(MG)組具有顯著性差異(P<0.05),說明模型可能造成脾臟指數(shù)降低。HD組與BG組無顯著差異,推測經(jīng)過猴頭菇多糖干預(yù),疲勞模型大鼠脾臟增長可能恢復(fù)至正常健康狀態(tài)。

表5 脾臟指數(shù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計比較Table 5 Statistical comparison of Spleen

3.6 猴頭菇多糖對大鼠血象的影響

如表6所示,各組實驗21 d后大鼠血象數(shù)據(jù)記錄如下:模型組(MG)大鼠白細胞指標(biāo)明顯高于其他實驗各組;模型組大鼠(MG)淋巴細胞顯著低于其他實驗組;推測經(jīng)過建立疲勞模型后大鼠可能出現(xiàn)炎癥癥狀,同時免疫系統(tǒng)能力降低;通過猴頭菇多糖干預(yù)后可以恢復(fù)至正常。

表6 血象指數(shù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計比較Table 6 Statistical comparison of blood

3.7 GC-MS分析

圖1 空白組、高劑量組與模型組多元統(tǒng)計分析圖Fig.1 Multivariate statistical analysis of BG, HD and MG groups

繼續(xù)使用SIMCA軟件將實驗結(jié)果中所有組分數(shù)據(jù)進行分析,PLS-DA得分圖顯示(圖2),其各給藥組與模型組區(qū)分良好,且遠離模型組,在一定程度上與正常組相接近,說明各給藥組對疲勞模型均具有一定的干預(yù)效果,猴頭菇多糖低劑量組與中劑量組有部分重疊,而高劑量組更接近正常組、遠離模型組,說明猴頭菇多糖高劑量對于疲勞模型干預(yù)作用更為有效。

圖2 不同劑量組PLS-DA分析圖Fig.2 PLS-DA analysis diagram of different dose groups

3.8 差異性代謝物的尋找與代謝通路分析

利用Simca-P14.1軟件篩選變量投影重要性(VIP)大于1的組分,將譜圖與NIST2017質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比較,運用質(zhì)譜裂解規(guī)律篩選獲得共計24種代謝物,分別為辛烷、乳酸、脲(尿素)、甘油(丙三醇)、N-甲基二乙醇胺、正十四烷、十七(碳)烷、正十八烷、L-5-氧代脯氨酸、2,4-二叔丁基苯酚、二十烷、正二十一烷、肉豆蔻酸、D-(+)-塔羅糖、軟脂酸(棕櫚酸)、正十八醇、2-甲基二十六(碳)烷、2-甲基二十四(碳)烷、9,12-十八碳二烯酸、油酸、9-十八烯酸、硬脂酸、1-棕櫚酸單甘油酯、硬脂酸甘油酯、膽固醇、β-谷甾醇、苯丙酸乙酯。比較各組差異性代謝物的相對峰強度,均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且統(tǒng)計分析獲取到不同給藥組間變化趨勢如表7所示。

表7 差異性代謝物及相對峰強度變化Table 7 Differential metabolites and relative peak intensity changes

將24個差異性代謝物上傳Metabo Analys 5.0分析平臺,利用KEGG和HMDB數(shù)據(jù)庫進行匹配后,進行代謝通路富集和代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖。推測共有3條代謝通路與猴頭菇多糖與抗疲勞模型有關(guān)(圖3、表8)。

圖3 代謝途徑影響值Fig.3 Impact of metabolic pathways

表8 大鼠受擾動的代謝通路Table 8 Disturbed metabolic pathway of rat

3.9 組織切片病理診斷

模型組大鼠腦HE染色切片顯示大鼠大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)正常,神經(jīng)細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞形態(tài)正常;神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)正常,形態(tài)正常;海馬結(jié)構(gòu)正常,其內(nèi)神經(jīng)細胞、膠質(zhì)細胞形態(tài)均正常,腦室結(jié)構(gòu)正常,視管膜細胞形態(tài)正常,脈絡(luò)叢結(jié)構(gòu)、形態(tài)均正常[圖4(a)、圖4(b)]。

圖4 大鼠腦HE染色切片F(xiàn)ig.4 Brain HE staining slice of rats

模型組大鼠胃HE染色切片顯示大鼠前胃黏膜層鱗狀上皮形態(tài)正常,黏膜下層、肌層和漿膜結(jié)構(gòu)均正常,前胃擴張,程度重度;腺胃黏膜層的壁細胞、主細胞、黏液細胞形態(tài)均正常,黏膜下層、肌層和漿膜結(jié)構(gòu)均正常,腺胃擴張,程度重度[圖5(a)、圖5(b)]。

圖5 大鼠胃HE染色切片F(xiàn)ig.5 Stomach HE staining slice of rats

模型組大鼠到實驗中后期開始拒絕飲食,非正常大量飲水,加血清上5-HT含量變化說明疲勞動物模型可能使模型組大鼠精神異常亢奮并出現(xiàn)非正常行為,從而影響胃黏膜正常結(jié)構(gòu)。

4 討論

9,12-十八碳二烯酸又名亞油酸[21],是一種公認必需脂肪酸,已經(jīng)成為MWD中最豐富的多不飽和脂肪酸。經(jīng)模型組大鼠血清中亞油酸含量高于其他各組,表明亞油酸代謝途徑受到干擾后無法正常流向下游代謝途徑致使脂質(zhì)代謝受阻。猴頭菇多糖給藥組大鼠血清中亞油酸含量趨于空白組,推測是通過調(diào)節(jié)亞油酸代謝調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[22]達到降低氧化損傷作用來改善大鼠疲勞損傷。

酪氨酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的重要氨基酸之一,研究表明,多種疾病的發(fā)生與酪氨酸代謝紊亂有相關(guān)性[23-24]。模型組大鼠血清中酪氨酸含量紊亂,猴頭菇多糖給藥高劑量組大鼠血清酪氨酸含量趨近于空白組,紅景天陽性對照組大鼠血清酪氨酸含量接近猴頭菇多糖中劑量組;推測大鼠疲勞損傷影響酪氨酸代謝,通過猴頭菇多糖干預(yù)可調(diào)整機體代謝趨向于正常。

甘油作為甘油三酯的前體,是脂質(zhì)代謝生化反應(yīng)中重要的前體物質(zhì),甘油三酯主要存在于脂肪組織,當(dāng)機體需要時,先將甘油三酯水解,生成甘油和脂肪酸;能夠通過參與多條代謝通路調(diào)控和完成生理代謝功能,如甘油酯類代謝、甘油磷脂類代謝等[25]。脂質(zhì)代謝異常[26]能夠引起人體多種疾病,可作為某些疾病的生物標(biāo)志物,也可用來考察某些病理條件下相應(yīng)的治療效果,如糖尿病、動脈粥樣硬化、血脂代謝紊亂[27]等。甘油酯是甘油和脂肪酸經(jīng)酯化所生成的酯,在機體內(nèi)負責(zé)貯存能量與輸送。代謝組學(xué)結(jié)果表明,模型組大鼠血清中甘油含量顯著升高,游離脂肪酸如棕櫚酸的含量上升,硬脂酸甘油酯含量降低,推測機體甘油酯類物質(zhì)的合成受到干擾,導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂,降低了能量提供水平,猴頭菇多糖給藥組使得對應(yīng)物質(zhì)含量趨向正常水平,推測其可以通過恢復(fù)機體甘油酯類物質(zhì)的合成從而使甘油酯代謝恢復(fù)正常。

過度疲勞[28]會使機體發(fā)生額外的代謝變化,包括能量產(chǎn)生途徑的變化、細胞氧化還原、炎癥反應(yīng)、線粒體功能障礙、AMPK激活減少和老年人群維生素D減少。通過上述實驗可得出,猴頭菇多糖具有較好的抗炎、抗氧化功效,可有效減少過度疲勞對細胞氧化、炎癥的影響。CFS的癥狀與加速衰老/過早免疫衰老具有共同特征[29]。而端粒長度是被廣泛使用的加速衰老標(biāo)志物[30],研究表明,CFS與端粒變短有顯著關(guān)聯(lián),長期過度疲勞不得緩解會加速端粒變短從而加速機體衰老,端粒短也與炎癥發(fā)生、惡性腫瘤的增加[31]有關(guān)。因此開發(fā)出更多抗疲勞藥物顯得極其需要。

5 結(jié)論

建立了力竭游泳動物模型,利用GC-MS分析方法,首次從代謝組學(xué)角度,并結(jié)合其他生化指標(biāo)探討了猴頭菇多糖對負重力竭游泳致大鼠疲勞模型的影響。研究結(jié)果鑒定出24種差異性代謝物,以脂肪酸物質(zhì)為主,涉及3條主要代謝通路,推測猴頭菇多糖通過脂質(zhì)和氨基酸代謝發(fā)揮抗疲勞作用。實驗采用的中醫(yī)證候動物模型與代謝組學(xué)相結(jié)合的研究方法,與中醫(yī)診治思想的整體觀相契合,對猴頭菇多糖抗疲勞干預(yù)作用進行闡釋,從代謝組學(xué)方面解釋了抗疲勞作用機制,給猴頭菇多糖的應(yīng)用、開發(fā)研究提供了依據(jù),同時也為猴頭菇多糖在其他疾病治療提供了新的研究思路。