基于網絡藥理學探討芒柄花素及其5個代謝產物治療心血管疾病的作用機制

張維茜,謝鑫蕊,楊玉竹,張亞洲

(貴州中醫藥大學,貴州 貴陽 550025)

心血管疾病又稱循環系統疾病,是一系列涉及循環系統的疾病。常見的心血管疾病有冠心病、心力衰竭、心絞痛、急性心肌梗死、病毒性心肌炎等疾病,常伴隨有呼吸困難、心悸、眩暈、暈厥等癥狀。在科技日益發展的今天,越來越多的學者開始關注心血管疾病的治療,尋找完善的治療心血管疾病的藥物就具有不同尋常的意義[1-2]。

芒柄花素(7-羥基-4'-甲氧基異黃酮)又名刺芒柄花素、芒柄花黃素,主要存在于黃芪的根部紅車軸草的花序和帶花枝葉、葛根、雞血藤等豆科植物中,易溶于甲醇、乙酸乙酯、乙醚、稀堿溶液,難溶于水,屬于異黃酮類化合物,是黃芪中異黃酮類化合物的代表成分[3]。芒柄花素對心腦血管具有保護作用,可對卒中后的神經損傷具有恢復功能[4]。此外芒柄花素還具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、雌激素樣作用[5]。近年來,研究者對芒柄花素的藥理作用做了大量研究,表明其具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、調血脂、抗血栓、抑制腫瘤等作用。為了更好地了解芒柄花素及5個代謝產物對心血管疾病的作用機制,以下將從網絡藥理學的角度來探討黃芪對心血管疾病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 相關數據庫網站及軟件的應用[6-8]

Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),SwissADME(http://www.swissadme.ch/),SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch),GeneCards(https://www.genecards.org/),Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/),String(https://cn.string-db.org/),PCA(www.bioinformatics.com.cn),RCSB PDB(https://www.rcsb.org),TCMSP(https://tcmsp-e.com/),Auto Dock,Pymol,PMW,Numpy,Miniconda,ChemBio 3D Ultra(https://www.chemdraw.com.cn/xiazai.html)。

1.2 化合物靶點收集

芒柄花素及其5個代謝產物6,7,4'-trihydroxy-isoflavonoid、7,4'-dihydroxy-isoflavonoid、7,8,4'-trihydroxy-isoflavonoid、7,8-dihydroxy-4'methoxy-isoflavonoid、6,7-dihydroxy-4'methoxy- isoflavonoid均為異黃酮類化合物,分別在SwissADME上畫出其結構,得到相對應的Isomeric SMILES號,并查看Pharmacokinetics中的GI absorption是否為High,Druglikeness中是否滿足兩個yes,若不滿足,說明該物質在體內分布、吸收、排泄、代謝效果不好,則淘汰該物質;若滿足,則將所得到的Isomeric SMILES號粘貼到SwissTargetPrediction,得到各化合物對應的靶點,收集靶點。

1.3 心血管疾病相關靶點的獲取篩選及交集靶點的收集

在GeneCards數據庫中以Cardiovascular disease為檢索名,檢索收集心血管疾病的潛在靶點,并篩選心血管疾病的潛在靶點,再將有效成分基因與篩選后的心血管疾病基因復制于網站Venny2.1中做韋恩圖,調整相應數據得到疾病-物質韋恩圖,點擊交集部分,獲得交集基因,將收集的交集基因復制粘貼到表格里。

1.4 PPI(蛋白相互作用)和成分-靶點網絡圖的構建

將以上收集到的交集基因粘貼于STRING數據庫中,調節相應參數,選擇靶點種類為“Homo sapiens(智人)”,“CONTINUE”默認為0.7,下載“PNG”和“TSV”文件。將“TSV”文件導入軟件Cytoscape3.9.1中進行PPI網絡作圖.將有效成分-心血管疾病的網絡文件和附屬文件導入軟件Cytoscape3.9.1中,進行藥物疾病靶點通路圖的繪制。再利用Cytoscape中的插件CytoNCA進行拓撲分析,通過分析和構圖展示可大致了解到有效成分治療心血管疾病相關度較高的交集靶點,從多成分、多靶點方面簡單展現了有效成分治療心血管疾病的機制。

1.5 分子對接

1.5.1 分子對接步驟及其相關參數

從成分-核心靶點-通路網絡中將基因靶點以degree 值高低進行排序,選擇前2個核心靶點(HSP90AA1、SRC)分別與分離得到的6個核心成分(1,sm2)6,7,4'-trihydroxy-isoflavonoid、(2,sm7)7,4'-dihydroxy-isoflavonoid、(3,sm9)7,8,4'-trihydroxy-isoflavonoid、(4,sm10)7,8-dihydroxy-4'methoxy-isoflavonoid、(5,sm12)6,7-dihydroxy-4'methoxy- isoflavonoid、Formononetin)進行分子對接。

1.5.2 分子預處理

核心靶點蛋白大分子的查找:在PCSB PDB(https://www.rcsb.org)數據庫中按照in Gene Name檢索靶點蛋白受體,選擇“HOMO”將Sort by設置為Resolution:Best to worst查找受體,分別為HSP90AA1、SRC,2個核心靶點蛋白大分子的蛋白名及PCSB PDB ID得到號。核心成分蛋白小分子的查找:在TCMSP(https://tcmsp-e.com/)數據庫中按照chemlcal name為搜索條件,將藥物核心成分依次輸入進行檢索,在點擊Molecule Information得到Molecule ID,點擊Download structure得到1個核心成分(Formononetin)分子結構的Molecule ID:MOL000392;按照相同操作,可得到(1,sm2)6,7,4'-trihydroxy-isoflavonoid、(2,sm7)7,4'-dihydroxy-isoflavonoid、(3,sm9)7,8,4'-trihydroxy-isoflavonoid、(4,sm10)7,8-dihydroxy-4'methoxy-isoflavonoid、(5,sm12)6,7-dihydroxy-4'methoxy- isoflavonoid相應的Molecule ID。

對核心靶點蛋白大分子的修飾:打開Pymol軟件,導入核心靶點蛋白大分子,對蛋白大分子去水(remove water), 去除配體和糖鏈(Remove atoms),導出文件為PDB格式。

打開Auto Dock軟件,點擊File的Read Molecule導入從RCSB PDB(https://www.rcsb.org)中得到的核心靶點蛋白大分子,點擊Edit對其進行加氫(Hydrogens)、計算電荷數(Compute Gasteiger)、確定原子剛性(Assign AD4 Type), 導出文件為PDBQT格式,

對核心成分小分子的修飾:打開Auto Dock軟件,點擊Ligand的Input導入從TCMSP((https://tcmsp-e.com/)和PubChe的核心成分蛋白小分子,依次點擊Torsion tree的choose Root, Detect Root, show Root Expansion, 以及choose Torsions的修飾步驟,導出文件為PDBQT格式。

1.5.3 盲盒對接

打開Auto Dock軟件,點擊Grid,然后點擊Macromolecule中的Open,導入文件格式為PDBQT的核心靶點蛋白大分子;再次點擊Grid,然后點擊Set Map Types中的Open Ligand, 導入文件格式為PDBQT的核心成分蛋白小分子。

選擇對接位點:繼續點擊Grid中的Grid Box來選擇對接盲盒的大小(2個核心靶點蛋白大分子與3個核心成分蛋白小分子盲盒大小如表3)。確定好對接盲盒大小,點擊File的Close Saving current;接著點擊Drid的Output, 導出文件為gpf格式。

1.5.4 分子對接可視化

由6個核心成分與對應的2個核心靶點的分子對接結果得到,6,7,4'-trihydroxy-isoflavonoid對應最低結合能是SRC核心靶點;7,4'-dihydroxy-isoflavonoid對應最低結合能是SRC核心靶點;7,8,4'-trihydroxy-isoflavonoid對應最低結合能是SRC下靶點;7,8-dihydroxy-4'methoxy-isoflavonoid對應最低結合能是HSP90AA1核心靶點;6,7-dihydroxy-4'methoxy- isoflavonoid對應最低結合能是HSP90AA1核心靶點;Formononetin對應的最低結合能是HSP90AA1核心靶點。打開Pymol軟件,導入以上對應的格式為PDBQT的文件,例如文件,6,7,4'-trihydroxy-isoflavonoid-SRC,以下均以此為例。首先找到配體,點擊Sele中的Color,改變配體顏色,便于區分。接著點擊Sele,點擊find中的polar contacts,選擇to others excluding solvent,得到配體小分子與蛋白大分子連接的氫鍵。

大蛋白棍狀結構的設置:先選擇配體,點擊Sele中的extract object,把配體單獨提出來;接著再選擇大蛋白,例如點擊3AYU-Mol000008的Show,選擇sticks,把大蛋白棍狀模型顯示出來。接著放大界面,找到與氫鍵連接的大蛋白中的殘基,然后點擊6,7,4'-trihydroxy-isoflavonoid中的Hide,點擊sticks, 與氫鍵連接的殘基之外的大蛋白棍狀隱藏起來;選中殘基,點擊Sele中的show, 點擊sticks把殘基的棍狀結構提出來,點擊Sele中的Color, 改變殘基的顏色,再點擊Sele中的Label, 再點擊residues顯示出殘基的名字。

計算殘基到核心靶點蛋白小分子之間氫鍵的距離:點擊Wizard, 然后點擊氫鍵連接的殘基與小分子兩端的原子,得到數值后點擊Done,結束運算。點擊Viewing, 然后按住Ctrl鍵,把界面中的殘基名字和氫鍵距離數值拖到空白地方,完成后點擊Editing。

調整核心靶點大蛋白結構透明度:點擊Setting, 選擇Transparency, 點擊Cartoon, 選擇60%。

調整背景顏色:點擊Display中的Background, 選擇Write。

點擊File中的Export Molecule保存文件,再點擊File中的Export Image As導出圖片。

2 結果與數據

2.1 有效成分預測靶點

相關6個異黃酮有效成分,見圖1。

圖1 有效成分結構

六個化合物均滿足SwissADME中的條件,則將所得到的Isomeric SMILES號粘貼到SwissTargetPrediction,得到各化合物對應的靶點。刪除重復項,得到靶點共240個。

2.2 有效成分-心血管疾病作用交集靶點

通過Genecards數據庫,得到心血管疾病預測靶點共16 554個,將疾病靶點與有效成分靶點交集于venny2.1.0.中,得到有效成分-心血管疾病交集靶點219個,交集率為1.3%。再向 String11.0數據庫中提交交集靶點,從而獲得交集靶點蛋白互作網絡圖,首先選中隱藏網絡中未連接的節點,最高置信度選擇0.700,主動交互源選擇Experiments,蛋白名字體大小選擇22,點擊Update,再點擊Export,選擇高分辨率位圖,導出PPI網絡圖,獲得交集靶點蛋白互作網絡圖,見圖2。

圖2 交集靶點互作圖

2.3 有效成分治療心血管疾病關鍵靶點篩選

調整各參數后導出BC值表格以及有效成分-心血管疾病交集靶點拓撲圖。在交集靶點的基礎上面將Betweenness Centrality值為0的以及Betweenness Centrality值為85以下的舍去,取Betweenness Centrality值由高到低的分成三份,最里層為Betweenness Centrality值最大的靶點,導出Betweenness Centrality值有效成分-心血管疾病交集靶點的拓撲圖(圖3)。

圖3 有效成分-心血管疾病交集靶點拓撲圖

2.4 分子對接結果

從拓撲圖網絡中將心血管疾病靶點以Betweenness Centrality(介數中心度)值高低進行排序,排名前十如表1,選擇前2個核心靶點(HSP90AA1、SRC)分別與分離得到的6個核心成分(1,sm2)6,7,4'-trihydroxy-isoflavonoid、(2,sm7)7,4'-dihydroxy-isoflavonoid、(3,sm9)7,8,4'-trihydroxy-isoflavonoid、(4,sm10)7,8-dihydroxy-4'methoxy-isoflavonoid、(5,sm12)6,7-dihydroxy-4'methoxy- isoflavonoid、Formononetin)進行分子對接。

表1 疾病靶點前十

分子對接結果(表2)顯示6,7,4'-trihydroxy-isoflavonoid、7,8,4'-trihydroxy-isoflavonoid、6,7-dihydroxy-4'methoxy- isoflavonoid、Formononetin4種成分與關鍵作用靶點SRC的結合能,7,4-dihydroxy-isoflavonoid成分與關鍵作用靶點HSP90AA1的結合能均小于-4.25 kcal/mol,說明兩者之間存在一定活性,最后發現7,8-dihydroxy-4'methoxy-isoflavonoid、6,7-dihydroxy-4'methoxy- isoflavonoid、Formononetin3種成分與關鍵作用靶點HSP90AA1的結合能以及7,4-dihydroxy-isoflavonoid成分與關鍵作用靶點SRC的結合能均小于-5.0 kcal/mol,說明兩者之間存在較好的結合活性。其分子對接模式圖見圖4～6。

表2 核心成分與對應核心靶點的分子對接結果

圖4 Formononetin成分與HSP90AA1靶點的分子對接模式

圖5 6,7-dihydroxy-4'methoxy- isoflavonoid成分與HSP90AA1的分子對接模式

圖6 7,4'-dihydroxy-isoflavonoid與SRC的分子對接模式

3 結論

通過網絡藥理學,可以得到心血管疾病與所分離六個化合物的交集靶點,根據BC值由大到小排序,選擇前兩個核心靶點與分離得到的六個化合物進行分子對接。結果顯示Formononetin與靶點HSP90AA1的結合能最低,為-5.37 kcal/mol,說明兩者之間,Formononetin與靶點HSP90AA1的結合活性最好,7,4'-dihydroxy-isoflavonoid與靶點SRC的結合能最低,為-5.01kcal/mol,說明7,4'-dihydroxy-isoflavonoid(compound2,SM7)與靶點SRC的結合活性最好。

最終總結得到芒柄花素治療心血管疾病的主要機制為化合物6,7,4'-trihydroxy-isoflavonoid、7,8,4'-trihydroxy-isoflavonoid、6,7-dihydroxy-4'methoxy-isoflavonoid和Formononetin與關鍵作用靶點SRC結合,7,4-dihydroxy-isoflavonoid與關鍵作用靶點HSP90AA1結合均起到一定的活性作用;而7,8-dihydroxy-4'methoxy-isoflavonoid、6,7-dihydroxy-4'methoxy-isoflavonoid、Formononetin與HSP90AA1靶點結合,7,4-dihydroxy-isoflavonoid與SRC靶點結合均有較好的活性作用;7,4-dihydroxy-isoflavonoid與SRC受體結合也具有較好的活性作用。主要還是Formononetin與它的主要代謝產物7,8-dihydroxy-4'methoxy-isoflavonoid、6,7-dihydroxy-4'methoxy-isoflavonoid與HSP90AA1受體和代謝產物7,4-dihydroxy-isoflavonoid與SRC受體之間較好的結合活性在治療心血管疾病中起到了關鍵作用。

本次關于Formononetin和它的糖苷(Onion)的研究。首先分離得到了6個Formononetin體外大鼠肝S9孵化后的代謝產物,并通過高分辨質譜鑒定了可能的代謝產物14個;然后通過體內給藥Onion后,對收集的大鼠尿液樣品經過高分辨質譜鑒定,鑒定得到可能的代謝產物21個。由于一個原型藥物在給藥后可能產生的代謝產物較多,具體起到治療作用的分子形式有可能是原型,也有可能是原型以外的代謝產物,需要進行具體的分析。最后對以上Formononetin體外大鼠肝S9孵化后分離得到的6個代謝產物進行網絡藥理學和分子對接技術分析,找到了10個與心血管疾病相關的受體,并對其中影響較大的兩個受體(HSP90AA 和SRC)與各分子結合能進行對比,發現Formononetin與它的主要代謝產物7,8-dihydroxy-4'methoxy-isoflavonoid、6,7-dihydroxy-4'methoxy-isoflavonoid在治療心血管疾病中可能與HSP90AA1受體之間存在較好的結合活性而發揮作用,而代謝產物7,4-dihydroxy-isoflavonoid則可能是與SRC受體之間存在較好的結合活性而發揮作用。最終芒柄花素及其代謝物通過作用于HSP90AA1受體和SRC受體的結合,達到了治療心血管疾病的目的。

同時通過網絡藥理學和分子對接,分析了Formononetin大鼠肝S9中孵化后分離得到的6個代謝成分與心血管疾病潛在靶點之間的關系,找到了6個代謝產物治療心血管疾病的主要作用受體10個。并對這些代謝產物與前2位受體HSP90AA 和SRC的結合活性強弱進行比較,找到對應受體結合能力最強的代謝產物,這些研究結果同時說明了一個原型藥物在給藥后可能產生的代謝產物較多,具體起到治療作用的分子形式有可能是原型或者也有可能是原型以外的代謝產物,需要具體進行分析。以上關于Formononetin和它的糖苷的研究,對后期它們的應用具有一定的指導作用。

綜上所述,網絡藥理學研究表明芒柄花素能通過不同作用機制改善并治療心血管疾病。本文基于網絡藥理學研究芒柄花素及5個代謝產物對心血管疾病的具體作用靶點及機制,找到芒柄花素治療心血管疾病的核心成分及核心靶點,并通過分子對接驗證了芒柄花素為治療心血管病的主要活性成分,對今后臨床運用具有重要指導意義。