基于網絡藥理學探討川牛膝治療高血壓的作用機制

梁林輝,梁大偉 ,章斌,林浩

(雅安職業技術學院 藥學與檢驗學院,四川 雅安 625000)

川牛膝(CyathulaofficinalisKuan,CNX)為莧科植物川牛膝的干燥根又稱為白牛膝、拐牛膝、甜牛膝,具有逐瘀通經,通利關節,利尿通淋的功效[1]。川牛膝在治療高血壓病中使用非常廣泛,通過中醫藥治療高血壓病總體用藥規律發現,常用中藥中川牛膝使用率排第二[2]。同時,在高血壓病診治中,將川牛膝作為降壓的基礎方之一來使用,降壓效果非常明顯[3]。在藥理學研究方面,發現川牛膝醇提物可能通過下調肺組織PI3K/Akt信號通路來抑制氧化應激反應,進而降低肺血管重構,因此可以降低野百合堿誘導的肺動脈高壓[4]。目前,川牛膝治療高血壓的具體作用機制不明確。網絡藥理學分析可作為一種研究由復雜成分的中藥或制劑的有效手段來揭示藥物發揮作用的藥理機制。因此,本研究借用網絡藥理學的方法,通過分析川牛膝的有效成分,預測川牛膝治療高血壓的靶點和信號通路,期望揭示川牛膝治療高血壓的分子機制,為川牛膝進一步臨床應用和基礎研究提供參考。

1 方法

1.1 川牛膝的活性成分和靶蛋白的獲得

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺數據庫(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform ,TCMSP)獲得川牛膝化學成分,然后基于藥代動力學參數吸收、分布、代謝、排泄(absorption、distribution、metabolism、excretion,ADME)中的口服利用度(Oral Availability,OB)≥20%,類藥性(Drug Like,DL)≥0.1進行活性成分篩選[5],同時通過查閱已公開發表文獻資料川牛膝中重要藥理活性的成分,結合兩種途徑獲得川牛膝化學成分。將篩選出的活性成分再通過TCMSP、本草組鑒(High-throughput Experiment and Reference Guided Database,HERB)數據庫中及瑞士靶點預測工具(Swiss Target Prediction,STP)獲取對應的靶蛋白,利用通用蛋白質資源庫(Universal Protein,Uniprot)進行基因標準化。

1.2 川牛膝治療肺高血壓關鍵靶點的獲取

通過在線《人類孟德爾遺傳》(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)數據庫,藥物數據庫(Drugbank),治療靶點數據庫(Therapeutic Target Database,TTD),毒性與基因比較數據庫(Comparative Toxicogenomics Database,CTD)和疾病基因網絡(Disease Gene Network,DISGENT)數據庫中,以“Hypertension”為檢索詞檢索疾病靶蛋白,其中CTD數據庫以“Inference Score”≥9.63為篩選條件,再對5個數據庫獲得的靶蛋白進行合并和去重,得到高血壓疾病靶點。

將川牛膝靶點與高血壓相關靶點利用在線作圖工具(http://www.biovenn.nl),獲取川牛膝與高血壓的共同靶點,獲得川牛膝治療高血壓關鍵靶點。

1.3 關鍵靶蛋白PPI網絡的構建

藥物發揮藥理作用除了作用于直接靶點調控之外,更多是直接靶點和間接靶點互相結合的調控方式。蛋白質-蛋白質之間的相互作用(Protein-Protein Interaction,PPI)分析有助于從系統的角度研究和挖掘藥物新靶點和闡明藥物治療疾病的分子機制。將川牛膝治療高血壓關鍵靶點導入String數據庫獲得PPI網絡數據信息,并將數據導入Cytoscape3.7.0軟件進行網絡構建和分析。

1.4 GO功能富集分析和KEGG分析

將川牛膝治療高血壓關鍵靶點導入Metascape數據庫進行基因本體論(Gene ontology,GO)以及京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析。以智人為篩選條件,顯著性閾值設為以P<0.01為選擇標準,對結果進行篩選,并做氣泡圖進行可視化分析。

2 結果

2.1 川牛膝的活性成分和靶蛋白的獲得

在TCMSP數據庫中搜索川牛膝得到藥物有效成分共41個。按ADME參數口服生物利用度OB≥20%,類藥性DL≥0.1篩選得到11個潛在活性成分;另外,通過查閱文獻發現cyasterone具有治療高血壓的潛在藥理作用[6],共組成12個川牛膝潛在活性成分。通過TCMSP、HERB、獲得活性成分靶蛋白,對于沒有靶蛋白的活性成分進行Swiss Target Prediction 靶點預測,對靶蛋白進行去重、通過Uniprote、Drugbank或美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)數據庫進行基因名轉換,刪除重復及無法獲得基因的蛋白,最終得到9個活性成分(見表1)及211個活性成分靶點。

表1 川牛膝主要活性成分

2.2 川牛膝治療高血壓關鍵靶點的獲取

以“Hypertension”為檢索詞收集高血壓相關靶點,在OMIM數據庫獲得148個靶點,在TTD數據庫獲得106個靶點,在CTD數據庫獲得1050個預測靶點(Inference Score≥100),在Disgenet數據庫獲得445個靶點,在Drugbank數據庫獲得178個靶點。將五個數據庫靶點集合并去掉重復最終得到高血壓相關靶點1540個。通過對疾病靶點與川牛膝作用靶點映射取交集,得到二者交集靶點170個。見圖1。

圖1 疾病靶點與藥物靶點韋恩圖

圖2 川牛膝治療高血壓的PPI網絡圖

2.3 關鍵靶蛋白PPI網絡的構建

將川牛膝治療高血壓的170個關鍵靶點導入String數據庫進行靶點分析和網絡預測,所得結果導入Cytoscape軟件進行網絡構建及可視化分析。隱藏無線的節點,用自由度Degree值表示圈的大小和顏色深淺,Degree值越大,圓圈越大,顏色越偏紅色,代表參與生物信號路徑越多,如圖3所示,發揮關鍵作用的靶點為IL6(Degree=78)、AKT1(Degree=74)、TP53(Degree=71)、VEGFA(Degree=70)、TNF(Degree=69)、PTGS2(Degree=64)、EGFR(Degree=63)、CASP(Degree=62)、MMP9(Degree=61)和STAT3(Degree=61)等。

圖3 川牛膝治療高血壓靶點的GO富集分析

2.4 GO功能富集分析和KEGG分析

將川牛膝治療高血壓的170個關鍵靶點導入Metascape數據庫,進行基因本體論GO和KEGG分析,其中,GO分子功能(Molecular function,MF)富集最高的20個涉及細胞因子受體結合、轉錄因子結合、核受體活性、血紅素結合、激酶結合等;GO細胞學組分(Cellular Component,CC)共15個,富集最高的涉及細胞膜筏、膜的側面、細胞頂端、細胞質核周區、細胞外基質等;GO生物學進程(Biological process,BP)富集最高的20個涉及炎癥反應、對傷害的反應、對脂多糖的反應、活性氧代謝過程、凋亡信號通路等。KEGG分析富集最高的20條信號通路主要涉及糖尿病并發癥AGE-RAGE 信號路徑、腫瘤的途徑、乙型肝炎、TNF信號通路、腫瘤中的蛋白質多糖等。川牛膝治療高血壓的生物學進程分析和KEGG分析如圖3～4。

圖4 川牛膝治療高血壓靶點的KEGG通路富集分析

3 討論

高血壓是常見的心血管疾病,以體循環動脈血壓持續高于正常水平為主要特征,能導致人的心、腦、腎、視網膜、血管等病理性改變,可誘發腦血管硬化和冠狀動脈粥樣硬化,嚴重威脅人類的健康。高血壓在中醫中歸屬“眩暈”“頭痛”等范疇,臨床表現有頭痛、頭暈、目眩、耳鳴等[7]。其中醫病因病機主要為營液內虛,水不涵木,木氣偏亢,甚則化風,治法治則以滋營陰、養肝腎為基礎,并結合風、痰、火、瘀等癥,隨證治之[3,8]。

川牛膝具有活血通經、滋肝補腎,強筋健骨、利水通淋、引火(血)下行的功效,中醫在治療高血壓用藥規律表明,川牛膝使用頻率極高[9]?，F代藥理學表明,川牛膝主要成分為三萜皂苷、甾酮、多糖,及少量黃酮類等成分[10],通過數據整理篩選出9種有效成分,主要為黃酮類槲皮素、葛根素以及甾體類如杯莧甾酮、紅莧甾酮、β-谷甾醇、齊墩果酸、西托糖苷等。槲皮素藥理作用廣泛,具有擴張血管及降壓作用,臨床試驗表面,槲皮素能直接激活人類血管平滑肌細胞KCa,提示槲皮素激活鈣激活鉀通道可能是其降血壓的一種機制[11]。同樣動物實驗證明,在高血壓合并腦卒中小鼠中,槲皮素能通過活化血小板,減少血小板炎性因子的釋放,進而降低腦血栓中血小板堆積的致密程度和覆蓋率,降低小鼠的腦梗死體積和神經評分,增加小鼠存活率[12]。槲皮素也可能通過調節腸道菌群,下調TLR4/NF-κB途徑,降低自發性高血壓大鼠血壓及改善心室重構[13]。葛根素主要存在豆科植物野葛的根,與槲皮素結構相似,葛根素通過 TRPC3 抑制 NF-κB 激活從而下調Cx43的表達,促進血管平滑肌細胞向收縮表型轉化,進而改善血管舒縮功能[14],并且在瘀血內阻型原發性高血壓疾病研究中發現,葛根素注射液聯合厄貝沙坦能有效控制血壓,改善臨床癥狀[15]。齊墩果酸作為一種具有廣泛活性的三萜類化合物,在高血壓動物模型上研究較多,可明顯改善高血壓動物收縮壓的升高,齊墩果酸的降壓作用也與其利尿作用相關[16]。通過SwissTargetPrediction 預測分析得到的川牛膝有效成分靶點Carboxylesterase 2[17]、11-beta-hydroxysteroid dehydrogenase 1[18]、Progesterone receptor[19]等明顯與高血壓有相關性,為進一步在體外或體內研究川牛膝治療高血壓的機制提供了方向。

高血壓的發病機制未完全清晰,疾病的發生可能是由多基因和環境共同照成的,與炎癥反應、脂多糖、活性氧代謝等因素密切相關[20-22]。本研究構建川牛膝治療高血壓PPI網絡,發現IL-6、AKT1、TP53等核心靶點。IL-6為白細胞介素-6,研究表明,越來越多的證據支持炎癥和免疫與高血壓有關,炎癥的發生會導致IL-6釋放,進而刺激單核細胞轉化為抗原呈遞細胞并產生IL-1β和IL-23等細胞因子,進一步影響T細胞功能以產生IL-17A。這些細胞因子能導致高血壓產生以及終末器官損傷[23],這也為高血壓的治療提供了新的方向。AKT磷酸化激活內皮一氧化氮合成酶,導致內皮血管松弛,進而影響血壓[24]。腫瘤抑制劑蛋白p53與動脈平滑肌細胞凋亡的分子機制有關,直接參與高血壓的發病機制[25]。

川牛膝治療高血壓關鍵靶點的GO功能富集發現,涉及炎癥反應、對傷害的反應、對脂多糖的反應、活性氧代謝過程、凋亡信號通路等。KEGG分析富集最高的20條信號通路主要涉及糖尿病并發癥AGE-RAGE 信號路徑、腫瘤的途徑、乙型肝炎、TNF信號通路、腫瘤中的蛋白質多糖等。通過富集分析及文獻可以推出,川牛膝治療高血壓主要通過以下幾個通路發揮調控血壓的作用。Ⅰ:炎癥反應相關通路。高血壓與免疫系統活化及遷移至多種靶器官如血管系統、腎臟、大腦、心臟等密切相關,炎癥機制對血壓調節及靶器官至關重要[26-28]。Ⅱ:糖尿病并發癥AGE-RAGE相關通路。AGE-RAGE在在高血壓患者的血漿中表達較高,影響動脈結構及血管功能。糖基化與受體反應可以導致氧化應激的發生,AGE與RAGE的相互作用可通過活性氧的產生,交感神經活性增加,NF-kB因子的活化以及細胞因子、細胞粘附分子和TGF-β的表達增加而產生高血壓[29-30]。目前,常用的降壓藥如卡托普利、氯沙坦等均為通過AGE-RAGE相關通路起到降低血壓的作用。Ⅲ:腫瘤及細胞凋亡信號路徑。高血壓以及持續性高血壓會誘發心肌形態學變化及心肌功能障礙,可導致心肌間質纖維化或心肌細胞凋亡[31-32]。減少心肌細胞的凋亡對預防和治療高血壓有重要的臨床意義。

總體來說,通過網絡藥理學研究發現了川牛膝可通過多靶點、多通路來治療高血壓。高血壓的發病機制復雜,而川牛膝有效成分多,需要系統研究中藥治療疾病的作用機制。本研究基于活性成分、核心靶點以及信號通路進行歸納分析,為進一步研究川牛膝治療高血壓的作用機制提供一定的方向。同時,也為中醫藥治療高血壓提供了思路及理論基礎。