HPLC-MS-MS法測定人血清中氟西汀、文拉法辛及其代謝產物與應用

張夫永,石文,陳飛

(1.江蘇吉諾思美精準醫學科技有限公司,江蘇 南京 210038;2.南京醫科大學附屬腦科醫院檢驗科,江蘇 南京 210029)

抑郁癥是一種常見的高發病率慢性精神疾病,復發率非常高,為威脅人類健康的主要疾病之一,隨著近年來人們生活節奏的加快及經濟下行壓力,發病率在臨床上上升趨勢明顯,同時,大多數患者病程遷延、病情波動易復發需要持續規則的藥物治療以控制癥狀和預防復發,對患者的家庭及所在的社會來說,容易造成長期負擔[1]。氟西汀(Fluoxetine, FXT)屬于5-羥色胺再攝取抑制劑,對5-羥色胺再攝取的顯著性抑制,提高了其在突觸間隙的濃度,從而產生了抗抑郁的效果,而對單胺酶則不會起到抑制的作用,實際臨床上比較常用且效果較好,但需要注意長期用藥帶來的不良反應,并且不能輕易停藥[2]。鑒于臨床實際應用,容易出現耐藥,FXT與其他藥物常聯合使用。FXT在體內可代謝為具有抗抑郁活性的去甲氟西汀(Norfluoxetine,N-FXT),治療參考濃度范圍為FXT與N-FXT之和,所以活性代謝產物的檢測也非常重要[3]。文法拉辛(Venlafaxine,VEN)屬于5-羥色胺和去甲腎上腺素雙重再攝取抑制劑,能夠同時阻斷去甲腎上腺素和5-羥色胺再攝取,提高突觸間隙5-羥色胺水平,從而實現抗抑郁效果,其安全性及患者的耐受性更高,具有高效的抗抑郁效果。VEN在體內通過細胞色素 P450(CYP) 2D6 代謝為具有活性的O-去甲基文拉法辛(O-Desmethylvenlafaxine,O-VEN)。O-VEN為其有效的活性代謝產物之一,也具有抗抑郁的作用[4]。臨床研究顯示[1],VEN緩釋劑聯合鹽酸FXT治療男性抑郁癥患者臨床效果更佳,且可以改善患者的認知功能和睡眠質量,不良反應較小,安全可靠。

近幾年發展起來的高效液相色譜-串聯質譜大大提高了靈敏度與特異性,在歐美發達國家得到廣泛應用,在中國臨床檢測的應用也越來越受到醫院的關注[5-6]。質譜技術不同于常規檢測方法,利用電磁學原理,直接檢測待測物質本身,具有特異性好、靈敏度高、多指標同時檢測的優點?；谫|譜技術,可以實現對體內血藥濃度水平的準確評估。本研究旨在通過HPLC-MS/MS,建立一種可快速同時測定人血清中FXT、VEN及其活性代謝產物濃度的方法,為臨床治療藥物監測提供檢測手段,并初步應用于臨床。

1 儀器與材料

1.1 試劑耗材

O-VEN,純度:98%,批號:GC11570,FXT,純度98%,批號:GC33715,VEN-d6,純度:98%,批號GC40205,FXT-d5,純度99%,批號GC50191,均購自美國GLPBIO公司;O-VEN-d6,純度:98%,批號:23Z299-T1,N-FXT-d5,純度:99%,批號:23Z297-T1,購自上海甄準生物有限公司;鹽酸N-FXT,純度98.11%,批號:G1267141,購自英國LGC公司;VEN,純度99.62%,批號:145231,購自美國TargetMol Chemicals 公司。甲醇、甲酸,色譜純,德國默克公司;空白血清由南京醫科大學附屬南京腦科醫院醫學檢驗科提供。

1.2 儀器設備

Thermo TSQ Endura 超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀(美國Thermo公司);TG16-WS臺式高速離心機(中國良友儀器公司);賽多利斯Quintix125D-1CN電子天平(德國Sartorius公司);可調式混勻儀VORTEX-1(山東博科集團)。

1.3 色譜條件

色譜柱:Phenomenex Kinetex Biphenyl (2.1 mm×50 mm,2.6 μm),流動相為含0.1%甲酸和1 mmol/L甲酸銨的水(A)和甲醇(B),梯度洗脫,0～1.0 min,體積分析30%B,1.0～2.0 min,體積分析30%～95%B,2.0～3.5 min,體積分析95%B,3.5～4.0 min,體積分析95%～30%B,4.0～4.5 min,體積分析30%B,流速:0.4 mL/min,柱溫:45 ℃,進樣量:5 μL。

1.4 質譜條件

電噴霧電離,正離子MRM掃描模式,噴霧電壓:3 500 V;鞘氣流速:50;輔助氣流速:10;吹掃氣流速:1;毛細管溫度:300 ℃。各物質的定量檢測離子對分別為m/z 310.2→m/z 44.5(FXT)、m/z 315.2→ m/z 44.5(FXT-D5)、m/z 296.2→ m/z 30.6 (N-FXT)、m/z 301.2→ m/z 30.6 (N-FXT-D5)、m/z 278.2→ m/z 58.4 (VEN)、m/z 284.3→ m/z 64.4 (VEN-D6)、m/z 264.2→m/z 58.4(O-VEN)、m/z 270.2→m/z 64.4(O-VEN-D6)。

1.5 對照品工作液制備

分別取VEN、O-VEN、FXT、N-FXT,對照品適量,精密稱定,以甲醇為溶劑,配制成 1 mg/mL儲備液,各儲備液按一定比例混合后,用50%甲醇水稀釋,得對照品工作液,質量濃度如下,VEN分別為360,720,1 440,2 880,7 200,14 400,36 000 ng/mL,O-VEN分別為360,720,1 440,2 880,7 200,14 400,36 000 ng/mL,FXT分別為200,400,800,1 600,4 000,8 000,20 000 ng/mL,N-FXT分別為640,1 280,2 560,5 120,12 800,25 600,64 000 ng/mL。

1.6 內標工作液制備

分別精密稱取內標對照品,以甲醇為溶劑,配制成 1 mg/mL儲備液,按一定比例混合后,用甲醇稀釋,加入0.5%甲酸,得內標工作液,各物質的內標質量濃度均為500 ng/mL。

1.7 標準曲線工作液制備

取對照品工作液5 μL至7個1.5 mL EP管中,各加入95 μL空白血清,渦旋10 s,得標準曲線工作液各100 μL。分析物在標準曲線工作液中的質量濃度如下,VEN分別為18,36,72,144,360,720,1 800 ng/mL,O-VEN分別為18,36,72,144,360,720,1 800 ng/mL,FXT分別為10,20,40,80,200,400,1 000 ng/mL,N-FXT分別為32,64,128,256,640,1 280,3 200 ng/mL。

1.8 血清樣品處理

取血清樣品50 μL至1.5 mL EP 管中,加入內標工作液150 μL,渦旋30 s,離心5 min,轉速12 000 r/min,吸取上清液,以純水稀釋一倍,作為待測液,準備上機檢測。

1.9 特異性和選擇性

分別取空白血清2份、添加最低濃度的對照品工作液的空白血清(即定量限濃度樣本)1份,按照血清樣品處理方法處理后檢測,其中1份空白血清處理中不引入內標校正(即雙空白血清)。

1.10 標準曲線與定量下限

標準曲線工作液7個濃度點,按照血清樣品處理方法處理后檢測。以分析物質量濃度為橫坐標(X),分析物峰面積與內標峰面積比為縱坐標(Y),進行線性回歸,繪制標準曲線。

1.11 精密度與回收率

取空白血清稀釋對照品工作液,分別配制低、中、高濃度加標血清樣品各5份,使得VEN及O-VEN的血藥質量濃度分別為45,180,1 350 ng/mL,FXT的血藥質量濃度分別為2.5,100,750 ng/mL,N-FXT的血藥質量濃度分別為80,320,2 400 ng/mL,按血清樣品處理方法處理,進樣分析,連續測定3批,數據分析軟件根據標準曲線,計算出各樣本質量濃度,并進一步計算批內批間精密度和回收率?；厥章实挠嬎愎?見下列公式(1)。

(1)

式中:P為回收率;C1:加標血清樣品質量濃度均值;C2:空白樣本質量濃度均值;C0:加入理論濃度。

1.12 穩定性

制備低、高質量濃度的血清質控樣品,在預處理后以及在所處評價的條件存儲后,立即分析。分別考察在常溫避光放置24 h、-18 ℃凍存1個月、反復凍融4次,等條件下的穩定性。

1.13 相對基質效應

制備含目標分析物的純溶液、空白血清樣本以及二者等比例混合液,分別處理后進樣分析。通過三種基質樣本中目標分析物與內標的峰面積比的偏差來衡量相對基質效應。計算公式如下:

(2)

式中:x——加入目標分析物的純溶液與空白血清樣本體積比1∶1混合后測定待測物與內標的峰面積比;

x1——空白血清樣本測定待測物與內標的峰面積比均值;

x2——加入目標分析物的純溶液中待測物與內標的峰面積比。

1.14 臨床樣本檢測

采集2023年6月份,南京腦科醫院,服用VEN的臨床抑郁癥患者樣本21例(男8例,女13例),服用FXT的臨床抑郁癥8例(男3例,女5例),檢測分析濃度分布情況。

2 實驗結果與討論

2.1 特異性和選擇性

本方法中,VEN、O-VEN、FXT、N-FXT及其各自內標,保留時間一致,VEN、O-VEN、FXT、N-FXT保留時間分別為,2.57,1.77,2.68,2.68 min,雙空白血清中不存在各分析物質峰及內標峰,單空白血清(即處理中引入內標校正空白血清)中,內標對分析物質的干擾峰響應,在定量限的20%以下,色譜圖,見圖1,可以認為,分析物質不受內標及內源性物質干擾,方法特異性和選擇性較好。

a-空白血清;b-空白血清+內標;c-空白血清+內標+定量限濃度各藥物對照品。圖1 血清中VEN、O-VEN、FXT、N-FXT及其內標的HPLC-MS/MS色譜圖

2.2 特異性和選擇性

線性方程分別為Y=0.003 262X-0.002 105,r2=0.999 3(VEN);Y=0.001 77X-0.003 348,r2=0.999 8(O-VEN);Y=0.002 751X-0.009 02,r2=0.999 7(FXT);Y=0.003 071X-0.002 516,r2=0.998 6(N-FXT);擬合曲線如下圖2所示,各藥物FXT、N-FXT、VEN、O-VEN分別在10～1 000,32～3 200,18～1 800,18～1 800 ng/mL內線性良好,定量限下限分別為10,32,18,18 ng/mL。

圖2 血清中VEN、O-VEN、FXT、N-FXT的擬合標準曲線圖

2.3 精密度與回收率

本方法中,各分析物批內批間精密度RSD均在15%以內,回收率85%～115%之間,結果見表1。

表1 精密度、回收率和基質效應結果

2.4 穩定性

血清樣本在常溫避光放置24 h、-18 ℃凍存1個月、反復凍融4次后,進行處理,測得值準確度也均在85%～115%之間,結果見表2。

表2 穩定性試驗結果

2.5 相對基質效應

本方法中相對基質效應均在20%以內,結果見表1。

2.6 臨床樣本檢測

采集2023年6月份,南京腦科醫院,服用VEN的臨床抑郁癥患者樣本21例(男8例,女13例),VEN加O-VEN,結果平均(263.89±176.67) ng/mL[VEN平均(106.92±101.86)ng/mL;O-VEN結果平均(156.97±100.64) ng/mL;服用FXT的臨床抑郁癥8例(男3例,女5例),FXT加N-FXT結果平均(139.12±121.3) ng/mL[FXT平均(79.33±87.28)ng/mL;N-FXT結果平均(59.79±40.09) ng/mL。所有臨床樣本,VEN加O-VEN以及FXT加N-FXT總檢測結果的濃度分布情況見圖3。

圖3 患者樣本檢測濃度的分布范圍

3 結論

1)本研究建立了VEN、FXT及其主要活性代謝物O-VEN、N-FXT的血清中血藥濃度HPLC-MS/MS平臺檢測方法,可一針同時測定其準確血藥濃度。

2)本研究方法已經用于臨床服用VEN、FXT的患者的血藥濃度檢測,連續檢測了2023年6月份,整一個月的樣本,目前的檢測結果均在本方法的線性范圍內,故而可以滿足臨床的檢測需求,但存在較大比例服藥患者血藥濃度超出有效治療范圍,尤其是FXT,有62.5%的服藥患者血藥濃度低于有效治療范圍下限,這意味著可能治療效果不佳或無效,而VEN有20%的服藥患者血藥濃度高于有效治療范圍上限,但低于藥物警戒濃度,這樣的檢測結果可能與人群的飲食生活習慣、個體代謝差異、患者用藥依從性差異以及藥物相互作用等有關[9],同時,樣本量仍處于低水平,也會影響結果判定,未來希望擴大樣本量,深入研究以上各因素對藥物濃度的影響。

3)有研究表明,針對抑郁癥患者,VEN與FXT聯合用藥,可發揮協同抗抑郁作用,尤其針對患者的認知功能及睡眠質量,有更好的臨床改善,副作用發生幾率較低[1,5,7];另一方面,它們的活性代謝產物亦有類似的抗抑郁活性,《神經精神藥理學治療藥物監測共識指南: 2017版》給出的治療參考濃度范圍為VEN、FXT與其各自的活性代謝產物濃度之和[1,3,6,8],故而本研究建立的快速同時測定人血清中FXT、VEN及其活性代謝產物濃度的方法,可為臨床精準個性化治療監測提供有利的支撐,有很好的臨床價值。